Хроническое воздействие УФ-излучения ведет к развитию биологического феномена, известного как «фотостарение кожи» и характеризующегося нарушением баланса основных процессов, обеспечивающих гомеостаз кожи [271; 300]. Одним из характерных изменений при этом считается гиперплазия тучных клеток, а также активация их синтетической, абсорбционной и секреторной функций [271]. В ответ на это ускоряются процессы клеточной пролиферации в генеративном компартменте эпидермиса. Последний подвергается редукции вследствие выравнивания дермо-эпидермального соединения, что приводит к смещению зоны камбиальных клеток в супрабазальные отделы [151].
При действии на организм глубокого охлаждения отмечается значительное уменьшение числа клеток Лангерганса и появление в них выраженных дегенеративных процессов, при этом они теряли характерную отростчатость, уменьшались в размерах, в них снижалась активность АТФ-азы [337]. После кратковременного холодового воздействия на кожу крыс и морских свинок обнаружено появление в базальном слое эпидермиса и концевых отделов сальных желез двух- и многоядерных клеток [19]. Действие холодового фактора, усиливает липолиз жира в жировой ткани, что ведет к выделению энергии, препятствующей быстрому охлаждению организма. В итоге основная площадь поверхности эпидермиса оказывается лишенной термоизоляционной жировой пленки [88].
Эти краткие сведения указывают на сложную морфофункциональную организацию эпидермиса, а также взаимодействие клеток в процессе кератинизации, регенерации, репарации и обеспечения защиты от действия окружающей среды и эдогенных факторов.
Предпосылкой развития хронического раневого процесса является невозможность завершения острого воспаления полноценной репарацией по той или иной причине. В любой фазе заживления возможно затяжное течение раневого процесса с вялым ростом грануляций и замедленной эпителизацией [33]. В хронических ранах цитологические показатели отражают клиническую картину замедленного роста грануляционной ткани и резкого снижения эпителизации ран. Наблюдается снижение продукции ростовых факторов, которые должны стимулировать рост грануляционной ткани, функции фибробластов и образование новых сосудов. Экспрессия PDGF и его рецепторов в незаживающих ранах у человека снижены по сравнению с острыми хирургическими ранами [341]. Аналогично, рост новых сосудов и уровень ангиогенных a-хемокинов снижены в длительно незаживающих ранах. Экссудат, полученный из венозных язв, особенно из тех, которые медленно заживают, ингибирует ангиогенез in vitro [417].
В хронических ранах наблюдается тяжелый дефицит эпителизации. При экспериментально индуцированных ранах описаны значительное снижение пролиферации эпидермиса и содержания эпидермальной ДНК. Замедленная эпителизация связана с нарушениями продукции цитокинов и ростовых факторов [689].
Основными причинами замедленного заживления ран служат пролонгированное воспаление с одной стороны, и снижение репаративных процессов в ранах - с другой [790]. При этом наблюдается дисрегуляция продукции хемотактических факторов для лейкоцитов, что приводит к пролонгированному присутствию нейтрофилов и макрофагов в ране и удлинению воспалительной фазы раневого процесса. При трофических язвах снижено количество Т-лимфоцитов в раневом очаге и наблюдаются дефекты функциональной активации раневых макрофагов [578]. Высокие уровни IL-1a и IL-1b присутствуют в раневой жидкости, полученной из трофических язв у человека. Концентрации IL-1 в раневой жидкости, взятой из длительно незаживающих ран, значительно превышали уровни этих цитокинов в заживающих ранах. Показано, что разница в продукции провоспалительных цитокинов не зависела от разницы в степени бактериальной обсемененности ран [789]. В то же время, в хронических ранах присутствуют в высоких концентрациях противовоспалительные цитокины – IL-1RA и IL-10 [761].
Galkowska et al., 2006 в своей работе описали усиление ряда факторов, регулирующих функции кератиноцитов в трофических язвах у человека, и предположили, что сниженная эпителизация связана с нарушениями функций самих клеток и плохим ростом грануляционной ткани. Сигналом к окончанию воспалительной фазы может служить появление в ране клеток в стадии апоптоза, что задерживает эпителизацию [365].
В развитии типичного раневого процесса наблюдают три основные фазы, последовательно сменяющие друг друга – воспаление, образование грануляционной ткани, эпителизация и восстановление. Для каждого этапа характерны свои особенности, как на клеточном, так и на молекулярном уровне [789]. В заживлении ран участвуют клетки крови и соединительной ткани, а также внеклеточный матрикс. В фазе воспаления происходит миграция лейкоцитов из сосудов в рану, активация функций лейкоцитов в раневом очаге, очищение раны от микробов и лизис нежизнеспособных тканей. На стадии формирования грануляционной ткани высвобождаются ростовые факторов для клеток соединительной ткани, и начинается активная пролиферация этих клеток и продукция ими компонентов внеклеточного матрикса. На этом этапе происходит образование новых кровеносных сосудов и начинается миграция эпителиальных клеток с краев раны. При созревании грануляционной ткани происходит массивный биосинтез компонентов внеклеточного матрикса и изменение его структуры. Начинается фиброзирование грануляционной ткани с образованием рубца, дифференцировка кератиноцитов на поверхности раны и ее эпителизация. Функции клеток на каждом этапе регулируются растворимыми ростовыми факторами и цитокинами [6].
При повреждении ткани происходит разрушение кровеносных сосудов и высвобождение их содержимого. Образование кровяного сгустка восстанавливает гомеостаз и обеспечивает временный матрикс для миграции клеток. Тромбоциты не только участвуют в образовании сгустка, но и секретируют медиаторы: эпидермальный ростовой фактор (EGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF) и трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), которые, присутствуя в раневой жидкости, привлекают и активируют макрофаги и фибробласты. Многочисленные медиаторы и хемотактические факторы индуцируются при свертывании крови и активации комплемента, а также при повреждении клеток паренхимы [11].
В первые минуты и часы после нанесения раны резко повышается продукция провоспалительных цитокинов в раневом очаге, тем самым стимулируется развитие воспалительного ответа. Значительная экспрессия IL-1a и b, TNF-a и IL-6 выявляется в тканях раны у мышей через несколько часов после нанесения раны [697]. В раннюю фазу IL-1 и TNF-a экспрессируются нейтрофилами, затем – макрофагами и мезенхимальными клетками, клетки регенерирующего эпидермиса также экспрессируют IL-1a, IL-6 и TNF-a [697]. IL-1a содержится в норме в эпидермисе человека, после нанесения раны продукция IL-1a отмечена в нейтрофилах, макрофагах и фибробластах. У человека в интактной коже IL-1b, TNF-a и IL-6 практически не определяются. Продукция IL-1b, TNF-a и IL-6 значительно возрастает в первые несколько часов, затем снижается до исходного уровня и появляется спустя несколько дней в грануляционной ткани опять [479]. Интактный эпидермис человека содержит большое количество IL-8, а при повреждении происходит выброс IL-8 из супрабазальных кератиноцитов как из резерва, что обеспечивает быстрое появление этого хемоаттрактанта в раневом очаге. Полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги осуществляют дополнительную продукцию IL-8, так как массивная экспрессия mRNA IL-8 отмечена в инфильтрирующих рану лейкоцитах [673]. В острых ранах определяются высокие уровни провоспалительных цитокинов IL-1, IL-6, TNFa и IL-8 [673; 761; 774].
Местное воспаление и заживление ран всегда ассоциировано с притоком нейтрофилов, макрофагов, лимфоцитов, а также тучных клеток в раневой очаг. Бактериальные продукты, такие как LPS, накапливаясь в первичном матриксе в инфицированной ране, усиливают направленную миграцию нейтрофилов. После нанесения раны активируются классические и альтернативные пути каскада комплемента, ведущие к продукции C5а, что также повышает хемотаксис нейтрофилов и моноцитов. Адгезия нейтрофилов к эндотелию является ключевым событием при развитии лейкоцитарного воспалительного ответа [621]. Экспрессия адгезионных молекул стимулируется провоспалительными цитокинами, такими как IL-1, что усиливает адгезию лейкоцитов к клеткам эндотелия и облегчает их трансмиграцию через эндотелиальный барьер [351].
Регуляция привлечения различных типов лейкоцитов в область кожной раны в разные фазы раневого процесса осуществляется посредством хемокинов. Основным хемоаттрактантом для нейтрофилов у человека является СXC-хемокин IL-8 [389], онкоген a, связанный с ростом (GROa) или у мышей макрофагальный воспалительный белок-2 (MIP-2) преимущественно привлекают в раневой очаг нейтрофилы, а GROa - также лимфоциты. СС-хемокины являются хемоаттрактанами для макрофагов и лимфоцитов, но не для нейтрофилов, основными являются моноцитарный хемотаксический белок-1 (MCP-1) и MIP-1a и b.
Нейтрофильные гранулоциты представляют собой первый защитный барьер на пути инфекции в раневой очаг. Инфильтрирующие ткани нейтрофилы очищают область раны от микроорганизмов и некротизированных частиц ткани, продуцируя протеиназы и свободнорадикальные формы кислорода и осуществляя активный фагоцитоз. Повреждение тканей и острое воспаление вызывают приток нейтрофилов в раневой очаг. Часть нейтрофилов пассивно выходит из сосудов при их разрушении, а другая часть проникает активно через стенки неразрушенных сосудов, при этом их траффик многоступенчато регулируется хемокинами. IL-8 индуцирует вторичный хемотактический ответ нейтрофилов. Массивная экспрессия IL-8 под поверхностью раны обеспечивает привлечение нейтрофилов из кровяного сгустка в раневой очаг. Пик уровня экспрессии IL-8 и GRO-a наблюдается в области накопления нейтрофилов в верхней части раны и снижается на 4 день, когда рана закрывается [435]. Повышенная экспрессия MIP-2 выявляется в норме с 1 по 5 дни раневого процесса в кератиноцитах, окружающих прилегающие к ране волосяные фолликулы [790]. В раневом очаге IL-8 продуцируется макрофагами, самими нейтрофилами, а также фибробластами и кератиноцитами, что обеспечивает дальнейший приток нейтрофилов. Раневая жидкость обладает хемотактическими свойствами для нейтрофилов за счет содержания в ней биологически активного IL-8 [673]. Помимо прямой индукции хемокинов бактериальными продуктами, TNFa и IL-1 стимулируют продукцию IL- 8, а IL-1 – MIP-2 [632]. Гипоксия, которая возникает под областью раны, может усиливать экспрессию IL-8. TNF-a сам является хемоаттрактантом для нейтрофилов и моноцитов. Наблюдается позитивная корреляция уровней TNF-a и IL-8 в раневой жидкости [673].
Встречаются единичные исследования, в которых показано, что, хотя нейтрофилы обеспечивают защиту от инфекций, нейтропения может улучшать заживление ран у мышей при определенных условиях [415; 610].
При нормальном заживлении раны через два дня количество нейтрофилов снижается, а доминирующую популяцию лейкоцитов представляют собой моноциты/макрофаги. Leibovich S.J. and Ross R. в 1975 году впервые показали, что удаление макрофагов из раны ухудшает заживление ран. Среди хемоаттрактантов для макрофагов в течение первой недели после ранения экспрессируется преимущественно MCP-1 [790]. Экспрессию mRNA MCP-1 наблюдали в пролиферирующем эпидермисе на краях раны и в мононуклеарных клетках в раневой области параллельно с максимальной макрофагальной инфильтрацией [435]. LPS, IL-1 и TNF-a индуцируют экспрессию MCP-1 эндотелиальными клетками. MIP-1 также играет важную роль в привлечении макрофагов [516]. Макрофагам отведена ключевая роль в регуляции заживления ран. Макрофаги осуществляют иммунологические функции как антиген-презентирующие клетки и фагоциты, в раневом очаге макрофаги являются основным источником провоспалительных цитокинов IL-1, TNF-a [361], хемокинов MIP-1a, IL-8, и ростовых факторов, таких как PDGF, TGF-a и b, IGF 1.
Т-лимфоциты могут играть регуляторную роль при заживлении ран. У мышей, лишенных лимфоцитов, нарушен синтез коллагена и снижена прочность рубца. Лимфоциты продуцируют IL- 2 и IFN-g, которые регулируют продукцию макрофагами ростовых факторов для фибробластов, а также продуцируют TGFa, который стимулирует синтез коллагена. Методом иммуногистохимии показано, что Т- и В-лимфоциты наряду с макрофагами присутствуют в биопсийном материале, взятом из краев ран у человека [357].
Роль цитокинов заключается в регуляции функций нейтрофилов в воспалительном очаге. TNF-a является одним из важнейших медиаторов, усиливающих функции нейтрофилов [822]. IL-1 может стимулировать функции нейтрофилов, но его действие является опосредованным через индукцию других цитокинов [359]. IL-8 является основным хемокином для нейтрофилов и привлекает эти клетки в раневой очаг [321]. IL-8 регулирует трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов. IL-8 может стимулировать адгезию нейтрофилов к эндотелию, эндоцитоз и респираторный взрыв. IL-6 не обладает хемотактической активностью для нейтрофилов in vitro, этот медиатор может регулировать привлечение нейтрофилов в раневой очаг in vivo. У линии мышей с дефицитом IL-6 наблюдается уменьшение лейкоцитарной инфильтрации, сопровождающееся снижением скорости заживления ран кожи [571].
Важная роль IL-1 в фазе воспаления подтверждается тем, что продукция IL-1 в пораженных тканях резко возрастает, начиная уже с первых минут после нанесения раны. Экспрессия mRNA и уровни продукции белков IL-1a и IL-1b повышаются в очаге на самых ранних стадиях раневого процесса. Максимальные значения продукции IL-1a отмечены через 7 часов после ранения [542]. Через несколько часов экспрессия IL-1a и IL-1b несколько снижается, а экспрессия IL-1b появляется снова спустя несколько дней в грануляционной ткани [479; 542]. Усиленная продукция провоспалительных цитокинов, IL-1 и TNF-a, на ранних этапах заживления раны служит для запуска каскада синтеза других цитокинов и ростовых факторов, а также для регуляции и координации функций клеток, принимающих участие в раневом процессе.
IL-1 продуцируется главным образом макрофагальными клетками, а при воспалении – нейтрофильными гранулоцитами и резидентными типами клеток [479]. Высвобождение IL-1 и TNF-a приводит к экспреcсии адгезионных молекул на эндотелии капилляров и способствует выходу лейкоцитов из кровяного русла в подлежащие ткани [489]. Нейтрофилы первыми мигрируют в раневой очаг в течение нескольких минут, за ними следуют моноциты и лимфоциты. Они продуцируют различные протеиназы и свободнорадикальные формы кислорода для защиты от микроорганизмов, а также осуществляют активный фагоцитоз. Под действием IL-1 происходит индукция продукции основных хемотактических факторов для нейтрофилов - IL-8 и MIP-2, а также TNF-a, который обладает хемотактическими свойствами для нейтрофилов и моноцитов [632]. IL-1 не оказывает прямого стимулирующего действия на нейтрофилы, но может действовать опосредованно через индукцию IL-8 и TNF-a. Преинкубация нейтрофилов человека с IL-1 («прайминг») повышает способность лейкоцитов отвечать на IL-8, FMLP и другие стимулы, усиливая хемотаксис, высвобождение ферментов и супероксидных радикалов и фагоцитоз [807]. IL-1 и другие провоспалительные медиаторы, удлиняют срок функциональной активности нейтрофилов в очаге воспаления за счет модуляции апоптоза [555].
После нейтрофилов в очаге воспаления появляются моноциты, которые дифференцируются в тканях в макрофаги. В первые дни после нанесения раны среди ряда хемоаттрактантов для моноцитов преимущественно экспрессируется моноцитарный хемотакcический белок-1 (MCP-1), продукция которого индуцируется IL-1 [715]. Лимфокины, секретируемые Т-лимфоцитами - IL-2, IFN-g и TGF-b, регулируют основные функции фибробластов [752]. Одной из основных функций IL-1 является стимуляция пролиферации лимфоцитов и продукции IL-2 этими клетками [534].
В фазе образования грануляционной ткани IL-1 может стимулировать рост и метаболизм соединительной ткани, а также реэпителизацию ран. Показано, что IL-1a и IL-1b повышают пролиферацию фибробластов и синтез глюкозамингликанов фибробластами кожи in vitro [715]. IL-1 также стимулирует продукцию ростовых факторов и IL-8 фибробластами [581]. IL-1a является основным аутокринным фактором, стимулирующим кератиноциты, поскольку кератиноциты продуцируют IL-1 [604]. IL-1a стимулирует миграцию кератиноцитов in vitro, и ускоряет заживление повреждений эпидермиса in vivo. IL-1 стимулирует организацию и дифференцировку эпидермальной ткани за счет стимуляции продукции KGF фибробластами [381]. При заживлении раны в грануляционной ткани происходит массивное образование новых кровеносных сосудов. Основными регуляторами ангиогенеза являются IL-8, TNF-a, VEGF. IL-1 значительно повышает экспрессию mRNA и секрецию этого фактора макрофагами [654]. В третью фазу, при переходе от грануляционной ткани к образованию рубца, происходит продолжительный синтез и распад коллагена. Влияние IL-1 на продукцию коллагена может быть разнонаправленным. IL-1 может увеличивать синтез коллагеназ. IL-1a и IL-1b могут усиливать продукцию коллагена фибробластами человека in vitro [473], а IL-1b увеличивает прочность раневого рубца in vivo [698].
Эксперименты по применению IL-1 для лечения осложненного заживления ран у животных дали положительный результат. Sauder et al. показали, что местные аппликации человеческого рекомбинантного IL- 1a значительно ускоряют заживление кожных ран у свиней [698]. Гистологическое исследование биоптатов показало, что применение IL-1a приводило к полной и нормальной регенерации эпидермиса. Vegesna et al. Результативно использовали человеческий рекомбинантный IL-1b для лечения осложненных ран у облученных мышей [770].
IL-1 может стимулировать рост и метаболизм соединительной ткани. Одним из основным свойств IL-1 является индукция синтеза простагландина Е2 фибробластами кожи человека. Показано, что IL-1a и b повышают пролиферацию фибробластов и синтез глюкозамингликанов фибробластами кожи in vitro. IL-8 повышает созревание грануляционной ткани и улучшает межклеточные коммуникации фибробластов [616].
После выхода из сосудов в воспаленную ткань нейтрофилы подвергаются апоптозу. Провоспалительные медиаторы – LPS, IL-1b, TNF-a - удлиняют срок функциональной активности нейтрофилов в очаге воспаления за счет ингибиции апоптоза [555]. При воспалении нейтрофилы могут сами являться важным источником цитокинов IL-1, IL-6, IL-8 и TNF-a [479; 697; 673].
В то время как провоспалительные цитокины и хемокины усиливают воспаление, существуют механизмы, позволяющие ограничить воспалительную реакцию, такие как снижение экспрессии рецепторов и продукция противовоспалительных цитокинов. IL-10 присутствует в раневой жидкости в высоких концентрациях. Экспрессия mRNA и продукция IL-10 определяется в ранах с момента нанесения раны и на протяжении всего времени заживления. Основными источниками IL-10 являются эпидермальные клетки и инфильтрирующие раневой очаг мононуклеары – макрофаги и лимфоциты. IL-10 ингибирует инфильтрацию нейтрофилами и макрофагами, снижает сверхэкспрессию СС-хемокинов и провоспалительных цитокинов IL-1b и TNF-a в ране in vivo [697].
Реэпителизация раны начинается через несколько часов после повреждения. Эпидермальные клетки из волосяных фолликулов замещают сгусток крови и поврежденную ткань на поверхности раны, отсекая струп от жизнеспособных тканей; через один-два дня эпидермальные клетки по краям раны начинают активно пролиферировать. Сами клетки претерпевают ряд морфологических изменений, а благодаря растворению полудесмосомных связей, клетки больше не прикреплены к базальной мембране, что обеспечивает возможность латерального движения клеток. Экспрессия интегриновых рецепторов на эпидермальных клетках позволяет им взаимодействовать с белками внеклеточного матрикса (фибронектином или витронектином). Продукция коллагеназы и активатора плазминогена эпидермальными клетками обеспечивает деградацию внеклеточного матрикса и миграцию этих клеток между коллагеном дермы и фибрином струпа.
Ряд стимулов активирует миграцию и пролиферацию кератиноцитов: отсутствие соседних клеток на краю раны, продукция хемокинов и ростовых факторов, таких как EGF, TGF-a и KGF, а также рецепторов для них в раневом очаге. IL-8 в экспериментах in vitro стимулирует миграцию и пролиферацию кератиноцитов человека [732]. Добавление IL-8 или GRO-a приводит к гиперпролиферации эпидермальных клеток в культуре. Показано, что гиперпролиферация кератиноцитов человека под действием IL-1a коррелирует с индуцированной IL-1 экспрессией IL-8 и GROa [732]. Экспрессия IL-8 и GROa обнаружена на раневой поверхности в области миграции кератиноцитов с краев раны [673]. Экспрессия наблюдается в тех же точках, но уровень mRNA GRO-a значительно ниже уровня mRNA IL-8, а продукция этих хемокинов коррелирует с миграцией кератиноцитов. При дефиците рецептора для хемокинов CXCR2 наблюдается замедление эпителизации in vitro и in vivo [408]. Местные аппликации IL-8 или GRO-a приводят к улучшению реэпителизации ран у мышей [732].
KGF является одним из основных специфичных регуляторов активности кератиноцитов. KGF стимулирует пролиферацию эпителиальных клеток in vitro, а также усиливает реэпителизацию экспериментальных ран in vivo при местном применении. Взаимодействия между мезенхимой и эпителием играют важную роль в контроле роста, развития и дифференцировки эпителия при заживлении ран. Экспрессия KGF происходит в клетках соединительной ткани, а эпителиальные клетки имеют рецепторы для этого фактора. Таким образом, KGF стимулирует эпителизацию через паракринный путь. Экспрессия KGF in vivo обнаружена в интактной коже у мышей и повышается более чем в 100 раз в течение 24 часов после ранения. Усиление экспрессии KGF наблюдается в острых ранах у человека. В обоих случаях MRNA KGF определяется в фибробластах края раны и грануляционной ткани. Важность рецепторного сигнала подтверждается тем, что у мышей с отсутствием рецепторов для KGF снижена реэпителизация ран [33].
IL-1 является одним из важных активаторов кератиноцитов. IL-1a активирует миграцию кератиноцитов in vitrо и стимулирует организацию и дифференцировку эпидермальной ткани в органотипической культуре [581]. IL-1a может стимулировать эпителизацию ран in vivo. IL-1 стимулирует организацию и дифференцировку эпидермальной ткани за счет стимуляции продукции KGF фибробластами [581]. IL-6 является митогеном для кератиноцитов in vitro. IL-6 может повышать эпителизацию ран, индуцируя KGF и TGFa. Применение экзогенного IL-6 восстанавливает эпителизацию ран у трансгенных мышей с дефицитом продукции IL-6.
Системное применение глюкокортикоидов снижает нормальную экспрессию IL-1, которая необходима при заживлении раны [335].
Заполнение раневого пространства грануляционной тканью начинается приблизительно через четыре дня после повреждения. В это время в ране появляются макрофаги, фибробласты и новые капилляры. Сосуды крови обеспечивают доставку кислорода и питательных веществ к клеткам новой стромы. Макрофаги служат основным источником ростовых факторов, стимулирующих фибробласты и ангиогенез [33].
Цитокины, продуцируемые на данной стадии заживления раны, главным образом действуют на пролиферацию фибробластов и/или выработку ими коллагена, а также продукцию внеклеточного матрикса. PDGF стимулирует пролиферацию, хемотаксис фибробластов и гладкомышечных клеток, и хемотаксис нейтрофилов и макрофагов, а также индуцирует реорганизацию системы актиновых филаментов. Экспериментальные и клинические исследования показали позитивное влияние PDGF на раневой процесс.
Суперсемейство TGFb является одной из сложных групп цитокинов, которые действуют на многие аспекты роста и развития клеток. TGFb может стимулировать или ингибировать рост фибробластов. TGFb у млекопитающих включает три изоформы b1, b2 и b3. Использование экзогенного TGFb улучшает заживление ран на фоне применения ГК.
Фибробласты являются также активным звеном в регуляции процессов заживления ран, поскольку эти клетки способны продуцировать ряд цитокинов и ростовых факторов. IL-1a и IL-1b стимулируют экспрессию KGF, IGF, IL-1a, IL-1b и рецептора IL-1 I типа (IL-1R1), а IL-1a и -b и TNFa повышают синтез IL-8 фибробластами кожи человека. Фибробласты, полученные из кожных ран, продуцируют TNF-a в ответ на LPS [581].
Роль экстраклеточного матрикса (ЭКМ) в процессах репарации очень значительна, поскольку сформированный матрикс выполняет не только механическую функцию, его компоненты также обладают способностью регулировать пролиферацию клеток и синтез цитокинов. Структурные молекулы вновь образованного (временного) ЭКМ включают фибрин, фибронектин, гиалуроновую кислоту и другие. Фибробласты являются клетками, которые синтезируют, откладывают и преобразуют компоненты ЭКМ, причем сам матрикс может оказывать позитивное или негативное влияние на эти функции фибробластов. Макрофаги продуцируют ряд компонентов ЭКМ, включая фибронектин и тромбоспондин. Макрофаги также продуцируют протеазы, которые вызывают деградацию ЭКМ, а также влияют на фибробласты и эндотелиальные клетки путем синтеза цитокинов.
Ангиогенез является сложным процессом, в который вовлечены внеклеточный матрикс и мигрирующие и пролиферирующие в нем клетки эндотелия. Анализ раневой жидкости показал присутствие в ней различных цитокинов, влияющих прямо или опосредовано на ангиогенез, включая IL-1, TNF-a, IL-8, IL-6, TGF-b. При заживлении раны в грануляционной ткани происходит массивное образование новых кровеносных сосудов. Основными регуляторами ангиогенеза являются TNF-a, IL-8, а также фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF). IL-1 значительно повышает экспрессию mRNA и секрецию этого фактора макрофагами [381].
Во вторую неделю заживления, фибробласты приобретают фенотип миофибробластов, характеризующихся большими пучками актиновых микрофиламентов, располагающихся под плазматической мембраной и межклеточными связями и связями с матриксом. Появление миофибробластов совпадает с началом уплотнения соединительной ткани и раневой контракцией. В третью фазу, при переходе от грануляционной ткани к образованию рубца, важная роль цитокинов заключается в регуляции созревания грануляционной ткани. Временный внеклеточный матрикс постепенно заменяется на коллагеновый, под действием различных факторов, таких как TGF-b. Затем фибробласты удаляются посредством апоптоза, что приводит к образованию относительно бесклеточного рубца. Влияние IL-1 на продукцию коллагена может быть разнонаправленным.
IL-1a и IL-1b могут усиливать продукцию коллагена фибробластами человека in vitro. Применение экзогенного IL-1b увеличивает прочность рубца после заживления раны в экспериментах in vivo. IL-1 также может увеличивать синтез коллагеназ. IL-6 вовлечен в регуляцию образования коллагена при заживлении ран кожи [571]. IL-8 ускоряет созревание грануляционной ткани in vivo. Обработка вживляемых под кожу крыс дисков с помощью IL-8 увеличивает количество тонких, более зрелых коллагеновых волокон, а также снижает количество клеток в грануляционной ткани [616].
Ряд цитокинов, таких как PDGF, TGFb1, IL-1, IGF-1 и IL-6, участвуют в патогенезе келоидных и гипертрофических рубцов, поскольку повышенная продукция этих факторов приводит к избыточному накоплению коллагена в ране [627].
В последние годы пристальный интерес исследователей вызывают влияние цитокинов на морфологию и функции плотных контактов в эпителии [458]. Белки плотных контактов - окклюдин и клаудины - являются двумя интегральными мембранными компонентами, которые формируют плотные контакты в эпителиальных тканях и культурах клеток эпителиального происхождения. Плотные контакты, липидные пластинки и роговые чешуйки поддерживают барьерную функцию эпидермиса. В языке эпителизации образование плотных контактов является важным этапом для формирования временного барьера эпидермиса. Широкий ряд цитокинов влияют на межклеточные ассоциации и проницаемость эпителиев и эндотелия.
Однако роль IL-1β в функционировании эпидермального барьера до последнего времени остается недостаточно изученной. Получены данные о том, что IL-1β в физиологических концентрациях (10 – 100 нг/мл) приводит к повышению проницаемости монослоя клеток кишечного эпителия Caco-2 и клеток эпителия сетчатки ARPE-19 (retinal pigment epithelial cells), а также снижает экспрессию окклюдина [305]. В то же время, IL-1β увеличивает экспрессию клаудина-1 в этих клетках. Важную роль клаудинов показали наблюдения над knockout-мышами по гену клаудина-1. Дефицит клаудина-1 приводил к дегидратации кожи, что вызывало гибель мышей [458].
Следует признать, что за пределами использования в практике дерматологов остаются сведения о возможностях воздействия на те или иные состояния субпопуляций клеток, учитывая столь масштабные сведения о каждом из них в отдельности. Целенаправленное иммунопатогенетическое воздействие при топическом ранозаживлении, с доказанной эффективностью применяемых средств, позволит решить большинство практических проблем дерматологии и косметологии в части заживления повреждений кожи.
Любое повреждение кожи запускает сложный каскад организованных во времени и пространстве событий, обеспечивающих восстановление гомеостаза и закрытие раневой поверхности [78; 622]. Этот процесс включает несколько фаз: воспаление, пролиферация (образование грануляций и эпителизация) и ремоделирование [567]. Каждая из фаз характеризуется реализацией определенных процессов с участием различных клеток иммунной системы кожи [78].
Так, в эпидермисе и дерме, дендритные клетки, обеспечивают нейтрализацию и элиминацию проникающих в рану патогенов. Их относят к наиболее мощным антигенпредставляющим клеткам [185; 711]. Они секретируют целый ряд веществ, необходимых для жизнедеятельности кожи, и в случае ее поражения и инфицирования продуцируют цитокины: IL-1, IL-6, TNF-a и IFN-g [537; 803]. Под влиянием IL-1 и TNF-a эпидермальные дендритные клетки (в основе своей клетки Лангерганса) активно мигрируют в дерму, откуда выносятся тканевой жидкостью в афферентные лимфатические сосуды, а затем в регионарные лимфатические узлы [224; 780]. Также, в дерме локализуются собственные дендритные клетки [185].
Повреждение сопровождается сосудистой реакцией и активацией системы гемостаза [475]. Этот процесс инициируется с первых секунд после повреждения и занимает несколько часов. Помимо эндотелия и тучных клеток, ключевыми клетками-участницами инициации воспаления являются тромбоциты [622].
Несмотря на то, что тромбоциты не имеют ядра, при активации в них происходит сигналзависимая трансляция резидуальной мРНК и, как следствие, de novo синтез белков, включая цитокины IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α и хемокины [78; 332; 362].
Развертывание фазы воспаления в течение 1-х суток неразрывно связано с активацией и миграцией в рану нейтрофилов [792]. Последние принимают участие в образовании тромба, удаляют поврежденные структуры ткани, фагоцитируют микроорганизмы с использованием набора протеаз (эластаза, катепсин G, PR-3, и uPA), секретируют широкий спектр эйкозаноидов, катионных белков и активных форм кислорода, потенцируют воспаление в ране, принимают участие в регуляции дифференцировки миофибробластов [78; 567; 622].
Важными регуляторами течения воспаления и его разрешения являются макрофаги, предшественники которых – моноциты, мигрируют из крови в зону раневого дефекта через 24-48 ч. Именно с макрофагами на сегодня связывают нарушение механизмов разрешения воспаления [471].
Под действием классических активаторов (INF-γ, бактериальный липосахарид, TNF-α) моноциты, рекрутированные в место повреждения из крови, дифференцируются в М1-макрофаги [328; 329], которые обеспечивают неспецифическую защиту и индуцируют развитие острой воспалительной реакции за счет продукции активных радикалов кислорода, провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-12, IL-23), хемокинов [329].
Разрешение воспаления ассоциировано с изменением фенотипа макрофагов и включение М2-фенотипа [471]. М1-макрофаги обеспечивают неспецифическую защиту и индуцируют развитие острой воспалительной реакции за счет продукции активных радикалов кислорода, провоcпалительных цитокинов – IL-1, IL-6, IL-12, IL-23, хемокинов, привлекающих в зону повреждения нейтрофилы, эозинофилы и моноциты, которые пополняют пул макрофагов в зоне раны, а также разные подтипы лимфоцитов [330; 471]. М2-тип макрофагов образуется при действии глюкокортикоидов, IL-4, IL-3, IL-10, TGF-β [622]. Изучение механизмов трансформации фенотипов макрофагов привело к переосмыслению их роли в регуляции раневого процесса [330]. Если раньше макрофагам отводилась роль дирижеров воспалительно-репаративного процесса, то в результате открытия и изучения классических и альтернативных путей регуляции фенотипов макрофагов стала понятной роль микроокружения – тех клеточных популяций в зоне раны, которые определяют специфику межклеточных коопераций и продукцию тех или иных регуляторных коктейлей [567]. Так, превалирование в зоне повреждения нейтрофилов, NK, Th1 и антигенпрезентирующих клеток, являющихся продуцентами INF-γ и TNF-α, предопределяет трансформацию моноцитов в М1-тип макрофагов. Тогда как превалирование тучных клеток, Th2 и Treg и гранулоцитов, являющихся продуцентами IL-4, IL-10 и TGF-β способствует формированию М2-фенотипа макрофагов [330; 471].
При этом трансформация в М2-фенотип сопровождается снижением экспрессии NF-kB и переключением метаболизма L-аргинина с iNOS пути на аргиназу 1. Эти события сопровождаются переходом на репаративный фенотип – снижается продукция провоспалительных регуляторов и усиливается образование противоспалительного IL-10, а также секреции TGF-β и простагландина Е2 [486]. Кроме того, М2-макрофаги продуцируют широкий спектр факторов роста, стимулирующих ангиогенез: VEGF – фактор роста сосудистого эндотелия) и репарацию дермы и эпидермиса, FGF – фактор роста фибробластов, EGF – эпидермальный фактор роста, TGF-β- трансформирующий фактор роста [349].
Во время фазы пролиферации, длящейся с 3 по 14 сутки, происходит формирование грануляционной ткани, эпителизация раневой поверхности и ангиогенез. Особенностью грануляционной ткани является особый клеточный состав: в ней много макрофагов, плюрипотентных прогениторов фибробластической линии и миофибробластов, а также большое количество эндотелиоцитов, выстилающих многочисленные новообразованные капилляры [349]. Межклеточное вещество грануляционной ткани богато фибронектином, гиалу- роновой кислотой и коллагеном III типа, который в процессе ремоделирования заменяется коллагеном I типа. Источником формирования грануляционной ткани, заполняющей раневой дефект, являются края и дно раны. Из этих зон макрофаги, миофибробласты и капилляры мигрируют в сторону раны, формируя взаимосвязанные функциональные комплексы (модули заживления). Миофибробластам при заживлении посвящено огромное количество исследований, позволившим установить источники и механизмы формирования клеток данной линии, ключевые стимуляторы и продукты секреторной активности данных клеток [500; 538]. Помимо компонентов межклеточного матрикса, миофибробласты секретируют многочисленные факторы роста, стимулирующие ангиогенез и эпителизацию раны, в частности, VEGF, KGF и EGF [538].
Изучение механизмов активации миофибробластов показало, что помимо механического стресса, ключевыми регуляторами формирования, пролиферации и дифференцировки миофибробластов являются TGF-β и PDGF [500]. К наиболее важным источникам синтеза TGF-β относятся М2 макрофаги и Treg клетки, в то время как основным продуцентом PDGF закономерно являются тромбоциты. Причем данный фактор роста, как, впрочем, и другие факторы роста, включая TGF-β и VEGF, накапливаются в α-гранулах тромбоцитов. Активация тромбоцитов и секреция α-гранул обеспечивает высвобождение факторов роста и стимуляцию репаративных процессов. Данный факт положен в основу использования аутологичной богатой тромбоцитами плазмы для стимуляции заживления хронических кожных ран, а также в других областях медицины, включая стоматологию, гинекологию, травматологию, косметологию и пр. [393].
Кроме того, внедрение в практическую медицину клеточных технологий привело к широкому использованию мезенхимальных стромальных стволовых клеток, получаемых из красного костного мозга или аутофибробластов, выделяемых из дермы кожи, в целях стимуляции заживления обширных ран кожи (после ожогов, травм) [413; 622]. Не менее перспективным считается использование прогениторов, выделяемых из гиподермы. Обилие в гиподерме сосудов микроциркуляторного русла, окруженных перицитами, которые являются источником формирования миофибробластов, позволяет рассматривать гиподерму как важный источник прогениторов для клеточной терапии обширных ран. На сегодня стали реальностью использование технологий липофилинга и липографтинга (введение или трансплантация прогениторов, выделенных из жировой ткани) как для стимуляции репаративных процессов в хирургии, так и для борьбы с возраст-ассоциированными изменениями кожи в эстетической медицине [413; 622].
Процесс реэпителизации также требует формирования новых клеток и их миграции для замещения погибших в результате повреждения кератиноцитов. Учитывая, что воспаление и образование грануляционной ткани сопровождается освобождением широкого спектра факторов роста и цитокинов, стимулирующих пролиферацию кератиноцитов, реэпителизация раны, казалось бы, не является проблемой. Однако, в реальности при глубоких повреждениях кожи, погибает не только эпидермис, но и эпителиальные производные кожи – волосяные фолликулы и железы. В обсуждении возможностей их восстановления особое значение приобретают эпителиальные стволовые клетки, их ещё называют – нишевые. В физиологических условиях эпителиальные стволовые клетки являются источником развития различных клеточных популяций, обеспечивающих формирование эпителиальных структур кожи – интерфолликулярного эпидермиса, волосяных фолликулов, сальных и потовых желез [413; 677]. Источником всех этих клеточных линий являются эпителиальные стволовые клетки, расположенные в области ложа волосяного фолликула [333]. В онтогенезе они являются источником формирования волос, а позднее и стволовых клеток сальных желез. При повреждении кожи, эпителиальные стволовые клетки ложа волосяного фолликула становятся источником восстановления интерфолликулярного эпителия [333]. Предполагается также, что есть особая группа эпителиальных стволовых клеток, обеспечивающих регенерацию эккриновых потовых желез [677]. В физиологических условиях пролиферация клеток в составе этих желез очень низкая, но она нарастает при раневом процессе, и может обеспечивать частичное восстановление интерфолликулярного эпидермиса.
Изучение механизмов действия эпителиальных стволовых клеток было расширено после открытия в составе CD34+ гемопоэтических клеток мононуклеарной фракции костного мозга относительно небольшой популяции эндотелиальных клеток-предшественников [670]. Полагают, что при структурной перестройке сосудистой сети в поврежденной ткани, в основе которой лежит развитие коллатеральных артериол и ветвление капилляров, возможно формирование микрососудов de novo с участием эндотелиальных клеток-предшественников, мигрирующих из костного мозга в периферический кровоток и далее в зоны ишемии [383; 670; 713; 743]. Показано, что в ответ на ишемию увеличивается число циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников [528]. Имеются доказательства возможности встраивания этих клеток в стенку капилляра с последующей дифференцировкой в зрелые эндотелиоциты. Однако доля клеток костномозгового происхождения, интегрированных в новообразованные сосуды скелетных мышц, пока не установлена, хотя она может быть весьма существенной в других тканях (например, в микрососудах головного мозга она составляет 26–42%). Эндотелиальные клетки-предшественники, как и другие CD34+ гемопоэтические клетки, способны активировать резидентные эндотелиальные клетки действием ангиогенных факторов [529]. Существуют данные об усилении неоваскуляризации после трансплантации эндотелиальных клеток-предшественников на моделях ишемии конечностей животных [448; 528; 619; 815].
Таким образом, в экспериментальных исследованиях механизмов действия и эффективности эпителиальных стволовых клеток получены результаты, свидетельствующие о перспективности клеточных технологий для лечения ран кожи.
Регенерация поврежденных мышечных волокон инициируется воспалением [754]. Однако известно, что эпителиальные стволовые клетки оказывают противовоспалительное и локальное иммуносупрессивное действие, устраняя дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в поврежденной ткани [641; 787]. С учетом этого факта, а также данных о том, что имеет место подавление клеточного и дисбаланс гуморального звена иммунитета [690], в каждом конкретном случае применение эпителиальных стволовых клеток для лечения должно быть аргументировано результатами исследований соотношения воспалительных и противовоспалительных (репаративных) процессов в пораженной области. На сегодняшний день такая методология не разработана ни в эксперименте, ни в клинической практике.
Известно, что с возрастом, подчиняясь правилу Хайфлика, уменьшается общее число эпителиальных стволовых клеток, в особенности мезенхимальных [641]. Следует упомянуть и сообщения об отсутствии эффекта клеточной терапии. В частности, применение мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациента не приводило к достоверному улучшению заживления язв на ишемизированной конечности [741], а введение только гемопоэтических стволовых клеток с фенотипом CD34+, выделенных из мононуклеарной фракции клеток аутологичного костного мозга, не улучшало эффективности клеточной терапии [741].
При этом стоит отметить, что полноценное восстановление эпидермиса и эпителиальных структур кожи, возможно лишь при условии сохранения эпителиальных стволовых клеток. Их потеря при глубоком повреждении, сопровождающемся разрушением волосяного фолликула, ведет к нарушению не только механизмов реэпителизации, но и гистоархитектоники дермы, утратившей структурообразующие микромодули волосяного фолликула и желез [333].
Это неизбежно проявляется в следующей фазе процесса заживления ран – ремоделировании. Ремоделирование подразумевает под собой процесс перестройки грануляционной ткани и замещение ее зрелой соединительной тканью, часто с формированием рубца. На этом этапе заживления существенные изменения претерпевает состав внеклеточного матрикса. Коллаген III типа замещается более прочным коллагеном I типа и снижается содержание фибронектина, меняется пространственная организация коллагена. Важную роль в процессе ремоделирования играют металлопротеиназы (ММР-1,2,3,9), обеспечивающие деградацию компонентов внеклеточного матрикса [486; 567]. Эффекты металлопротеиназ ограничиваются действием тканевых ингибиторов. Баланс активности металлопротеиназ, по сути, предопределяет объем межклеточного матрикса и вероятность формирования атрофических или гипертрофических рубцов [349]. Реализация процесса ремоделирования занимает недели и месяцы и неизбежно сопровождается активацией системы адаптивного звена иммунитета. Так, исследования Motwani MP et al. [615] показали позднее (через 21-22 сут) повышение уровня Е2, и изменение количества в зоне раны макрофагов и Т-лимфоцитов, включая Treg. Это требует дальнейшего изучения роли иммунокомпетентных клеток в механизмах заживления ран [78].
Таким образом, заживление ран является сложным многофакторным процессом, реализующимся на динамичных взаимодействиях клеток и регуляторов. Дальнейшее изучение кинетики клеток разных линий позволит оценить роль и механизмы реализации разных межклеточных коопераций, что является условием разработки новой стратегии управления раневым процессом. Наиболее перспекттивным в этом направлении выглядит изучение репаративного потенциала эпителиальных стволовых клеток – «нишевых клеток» и сигнальных молекул адгезии.
