Длительное время единственным способом получения объективной информации о морфофункциональном состоянии клеток кожи оставалась инцизионная биопсия, инвазивность которой ограничивала ее применение и практически исключала динамические наблюдения. Динамика функционального состояния кожи, обеспечиваемая постоянным обновлением состава рециркулирующих лимфоцитов между регионарными лимфатическими узлами, кровью и кожей и создающая тем самым иммунный гомеостаз, вызывает сложность в исследовании свойств субпопуляций клеток, но одновременно и открывает возможность более детального постижения иммунных механизмов с ориентиром на практическую полезность [48; 50].
Так, неинвазивные методы исследования кожи – корнеометрия, себуметрия, кутометрия, профилометрия [2], а для глубоких исследований – оптическая когерентная томография, ультразвуковая микроскопия, магнитно-резонансная томография [81], описывая ряд свойств кожи, не дают возможности оценить сложный комплекс межклеточных взаимодействий. При всей своей убедительности в решении отдельных задач дерматологии они не позволяют получить достоверных сведений о функциональных различиях клеток кожи в количественном выражении [48].
Ярким исключением из этого списка является конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ), которая стала одним из наиболее распространенных методов флуоресцентной микроскопии для трехмерных структурных исследований клеток и тканей. Гибкость этого подхода позволила применить его в разнообразных исследованиях: от быстрой визуализации динамических процессов в живых клетках до тщательного морфологического анализа тканей и совместной локализации паттернов экспрессии белков [338].
Являясь неинвазивной диагностикой заболеваний кожи in vivo, она позволяет получать гистопатологические изображения патологических процессов в эпидермисе, дерме, дериватах кожи с возможностью изучения клеточных структур. По разрешающей способности она приближена к патоморфологическому исследованию кожи с чувствительностью и специфичностью метода от 80 до 98,6% [131; 474; 667].
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп был впервые разработан и запатентован в 1957 году профессором Массачусетского технологического университета Marvin Lee Minsky [131; 600]. Однако это изобретение осталось в значительной степени невостребованным из-за отсутствия источников интенсивного света, необходимых для получения изображений, а также компьютерного оснащения, необходимого для обработки больших объемов данных. В конце 1960-х годов David Egger и Mojmir Petran изготовили многолучевой конфокальный микроскоп, где использовал вращающийся диск для исследования неокрашенных срезов мозга и ганглиозных клеток. В последующем David Egger раз- работал первый механический сканирующий конфокальный лазерный микроскоп и опубликовал первые изображения клеток в 1973 году. В конце 1980-х годов были достигнуты успехи в области компьютерных и лазерных технологий в сочетании с новыми алгоритмами для цифровой визуализации изображения, что привело к растущему интересу к конфокальной микроскопии [72; 639]. Так, Tony Wilson et al. разработали концепцию и продемонстрировали полезность конфокальной визуализации при исследовании флуоресцентных биологических образцов. Первые конфокальные микроскопы появились в 1987 году и уже в 1990-х годах достижения в области оптики и электроники позволили получить более стабильные и мощные лазеры, высокоэффективные сканирующие зеркальные блоки, высокопроизводительную волоконную оптику, улучшенные тонкопленочные диэлектрические покрытия и детекторы с пониженными шумовыми характеристиками. Кроме того, начали синтезировать флуорохромы, которые были более тщательно подобраны к линиям лазерного возбуждения. Разработка высокотехнологичного прибора, использование быстросканирующих зеркал вместо медленного перемещения образца и возможность устранения размытия вне фокуса для получения серии тонких оптических срезов образца в 3D революционизировали флуоресцентную визуализацию с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии [72; 308; 639; 773].
В дерматологической практике КЛСМ используется последние 20 лет [131; 600]. Современные конфокальные микроскопы можно рассматривать как полностью интегрированные электронные системы, в которых оптический микроскоп играет центральную роль в конфигурации, состоящей из одного или нескольких электронных детекторов, компьютера (для отображения, обработки, вывода и хранения изображений) и нескольких лазерных систем, в сочетании с устройствами выбора длины волны и блоком сканирования луча [661]. Принцип визуализации микроскопических элементов кожи обеспечивается трехмерным разрешением за счет создания так называемых «оптических сечений» с использованием простой геометрической оптики. В стандартном широкоугольном микроскопе флуоресценция, генерируемая образцом, улавливается линзой объектива и передается непосредственно на детектор, позволяя делать виртуальные оптические срезы образцов, отклоняя расфокусированный свет для создания трехмерных изображений образцов с высоким разрешением [370; 666]. Конфокальные микроскопы достигают этого за счет использования конфокальной апертуры на пути луча обнаружения. Флуоресценция, собранная объективом от образца, ретранслируется обратно через сканирующие зеркала и через главное дихроичное зеркало, для отражения более коротких длин волн, луча лазерного возбуждения, при прохождении более длинного флуоресцентного излучения со сдвигом Стокса. Этот длинноволновый сигнал флуоресценции затем передается на пару линз по обе стороны от точечного отверстия, расположенного в плоскости, точно сопряженной с фокальной плоскостью линзы объектива. Фотоны, собранные из фокального объема объекта, коллимируются линзой объектива и фокусируются конфокальными линзами через точечное отверстие. Флуоресценция, генерируемая выше или ниже фокальной плоскости, не будет правильно коллимирована и не будет проходить через конфокальное отверстие, создавая оптическое сечение, в котором виден только свет из фокуса микроскопа. Таким образом, точечное отверстие эффективно действует как виртуальная апертура в фокальной плоскости, ограничивая детектируемое излучение только одним ограниченным пространственным местоположением [72; 372; 432; 624].
В микроскопе VivaScope 1500/3000 («Lucid-Tech. Inc.», Henrietta, NY; «MAVIG GmbH», Munich, Германия) используется диодный лазер с источником монохроматического и когерентного света, который проникает в глубину кожи и подсвечивает структуры внутри кожи. Длина волны 830 нм позволяет исследовать структуры кожи на глубину до 300 мкм — соответствует папиллярному слою дермы. КЛСМ-изображения, каждый размером 500×500 мкм, сканируются горизонтально и послойно, с шагом 5×5 мкм. Процедура проведения исследования на конфокальном микроскопе происходит относительно легко, быстро и безболезненно для пациента [561; 665; 666], позволяя получать качественные изображения in vivo для визуализации и диагностики заболеваний [477; 624]. Дополнительными преимуществами КЛСМ являются исследования в сложнодоступных для дерматоскопии и инцизионной биопсии локализациях; определение места инцизии с ярко выраженными морфологическими симптомами для максимально информативного в дальнейшем патоморфологического исследования и динамического наблюдения в процессе лечения хронических дерматозов [131].
По сути, экстенсивное развитие дерматологии сформировало приверженцев двух крайностей в исследовании кожи. Одни авторы, опираясь на возможность проводить исследования кожи и ее функций неинвазивными методами, лишают себя сведений на уровне клеток – там, где открывается колоссальный объем информации о природе воспалительных реакций. Другие же актуализируют инвазивные методы, которые хоть и позволяют исследовать кожу на клеточном уровне, но возможности оценить функцию клеток не дают, поскольку работают с фиксированной тканью, которая, как известно, функционально не активна.
Объектами исследования методом КЛСМ являются живые клетки и фиксированные препараты (как отдельные клетки, полученные из соскобов слизистых покровов или проб крови, так и фрагменты тканей из биоптатов) [72; 522; 531; 694]. Предметом исследования КЛСМ в медицине являются органеллы клетки, их структурная организация, внутриклеточный транспорт и межклеточные взаимодействия, позволяющие изучать особенности течения заболеваний на молекулярном уровне [35].
В практической деятельности врача-дерматовенеролога диагностика истинной пузырчатки базируется на клинической картине заболеваний, данных цитологического, гистологического и иммуногистохимического (РИФ) методов и представляет трудности, но при этом является основой назначения адекватного лечения больному, а подчас служит сохранению ему жизни [84; 155]. С помощью КЛСМ в режиме реального времени можно получить изображения эпидермиса и верхнего слоя дермы с высоким разрешением, что позволяет различить не только отдельные клетки, но и некоторые субклеточные структуры [199; 242; 276; 560].
Снимки КЛСМ представляют собой полутоновые изображения и являются горизонтальными оптическими срезами (в отличие от вертикальных срезов кожи при гистологическом исследовании), что может вызывать некоторые трудности в сравнении результатов с данными, получаемыми при традиционной биопсии [193]. Однако точно дифференцировать клетки инфильтрата невозможно, а метод конфокальной микроскопии может со временем заменить гистологический [242].
Таким образом, современная дерматология, прежде всего, как наука, испытывает настоятельную потребность в прижизненных методах морфофункционального исследования кожи. Неразличимость состояний кожи на клеточном уровне и оценка клеток, фиксированных только гистологическими методами, не позволяют дерматологам в полной мере оценить динамику заболевания кожи, степень реагирования кожи на воздействия среды, функциональную активность клеточных субпопуляций кожи в условиях нормы и патологии, объективизировать критерии возрастных изменений кожи и оценить эффективность применяемых лекарственных и косметических средств.
Это обстоятельство делает актуальным изучение фенотипа клеток кожи [8]. Тем более что динамика увеличения разнообразия заболеваний кожи намного выше скорости активного использования новых методов диагностики. При этом технологизация и развитие таких смежных областей медицины, как иммунология и цитология, стимулируют технологическое обновление дерматологии.
