Роль антиапоптотического действия ранозаживляющего средства CELLGEL в условиях in vitro

Ключевые слова: ранозаживляющее средство Cellgel, репаративная регенерация,  апоптоз, проточная цитометрия

На сегодняшний день является бесспорным мнение, что любое ранозаживление — это комплекс мероприятий, направленных на все звенья патологического процесса [1]. Одним из перспективных направлений является применение новых технологий, в частности разработка препаратов, обладающих способностью к нейтрализации и элиминации патогенных микроорганизмов, хорошо проникающих в рану и обладающих репаративными свойствами. Ранозаживляющее средсво «Цельгель» [2] разработано с учетом фазы течения раневого процесса, что позволяет применять его при повреждениях кожи различной этиологии. Действующее вещество средства «Цельгель», полученно из экстракта клеток куриного эмбриона, обладает антибактериальной активностью, а так же активизирует процессы репаративной регенерации кожи [3]. Процессы заживления подчиняются тем же принципам, что и любая соединительная ткань в организме, которые регулируется через клеточно-клеточные и клеточно-матриксные сигналы и процессы пролиферации и апоптоза. Американские ученые из в своем исследовании показали, что апоптоз играет важную роль в поцессах регенерации ткани при заживлении раны [4]. Если процесс апоптоза не возникает, то воспалительные процессы продолжаются, поскольку из некротизированных клеток продолжают поступать провоспалительные факторы, такие как, например, лизосомальные протеолитические ферменты и метаболиты арахидоновой кислоты. Замедление же процессов аппоптоза приводит к замене грануляционной ткани окончательной рубцовой тканью. Для понимания роли апоптоза в образовании рубцовой ткани необходимы дополнительные исследования, результаты которых, возможно, помогут разработать патогенетически обоснованное лечение и профилактику рубцов.

Цель – изучить влияние вещества, выделенного из экстракта клеток куринного эмбриона, на жизнеспособность и процессы апоптоза клеток в культуре, в засисимости от разных концентраций.

Материалы и методы

Исследуемое вещество получали по авторскому методу [2]. В качестве объекта исследования были выбраны клетки суспензионные культуры THP-1 (клетки моноцитарной лейкемии человека). Культивирование клеток линии THP-1 осуществляли с использованием среды RPMI-1640 («Биолот», Санкт-Петербург) с добавлением 10% инактивированной ЭТС («Биолот», Санкт-Петербург), 50 мкг/мл гентамицина («Биолот», Санкт-Петербург) и 2 мМ L-глутамина («Биолот», Санкт-Петербург). Пересев производили каждые 2-3 дня. Для ведения клеток использовали пластиковые флаконы объемом 50 мл («Sarstedt», Германия). Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂. При постановке экспериментов в лунки 96-луночного плоскодонного планшета («Sarstedt», Германия) вносили 200 мкл клеточной суспензии (2×10⁶ клеток в мл) в соответствующей полной культуральной среде. В качестве индуктора апоптоза использовали камптотецин, основной проапоптотической действие которого основывается на подавление активности ДНК топоизомеразы I, в финальных концентрациях 1 и 0,2 мкМ. Вещество интереса вносили в финальных концентрациях 7, 70 и 350 мкМ. Также инкубацию клеток осуществляли в присутствии обоих стимуляторов. Время инкубации в присутствии стимуляторов составляло 24 часа 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Оценку жизнеспособности клеток проводили при помощи проточной цитофлуориметрии. Для оценки относительного содержания клеток, находящихся на разных стадиях апоптоза, применяли два флуоресцентных красителя PI и YO-PRO-1 по описанное ранее методике[5]. При окраске клеток к 100 мкл клеточной суспензии (2-3×10⁶ клеток/мл) добавляли раствор YO-PRO-1 («Invitrogen», США) в финальной концентрации 250 нМ и раствор йодистого пропидия («Sigma-Aldrich», США) в финальной концентрации 1 мкг/мл. Окраску проводили при комнатной температуре в течение 15 минут в защищенном от света месте. По завершении инкубации к образцам добавляли по 200 мкл ЗФР и анализировали на проточном цитофлуориметре Navios™ («Beckman Coulter», США). Для каждого из образцов анализировали не менее 20000 одиночных клеток. Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программ Navios Software v.1.2 и Kaluza™ v.1.2 (Beckman Coulter, США). 

Матричный анализ

Концентрации камптотецина и вещества, использованные в экспериментах, обозначим через множества: X={x_1,x_2,...x_n},X∈R и Y={y_1,y_2,...y_n},Y∈R, соответственно. Каждой паре значений (x_i; y_i) соответствуют процентные значения величины гибели клеток на ранней стадии от апоптоза (z_i) и на поздней стадии от апоптоза и некроза (z'_i). Таким образом, мы получаем две матрицы, в которой вектор-строки (x_i; y_i; z_i) и (x_i; y_i; z'_i) определяют точки, лежащие на двух поверхностях в трехмерном пространстве R³. Полученные данные в виде двумерного массива обрабатывались с помощью языка программирования Python (Python Software Foundation, http://www.python.org) и модулей SciPy и Numpy. На первом этапе проводилось формирование узлов двумерной сетки с помощью функции numpy.meshgrid [6] , а затем данные интерполировались с помощью функции scipy.interpolate.griddata [7]. Графическое построение поверхностей выполнялось с помощью модуля Matplotlib. Также статистическую обработку проводили при помощи программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft, США). Результаты выражали в виде % позитивных клеток. Сравнение относительного содержания клеток на различных стадиях апоптоза между экспермиетами проводили при помощи t-критерия Стьюдента.

Результаты

В контрольных образцах клеток линии ТНР-1 относительно содержание живых клеток составляло 96,53±0,46%. Внесение вещества в финальной концентрации 350 мкг/мл сопровождалось достоверным снижение (р<0,001) относительного содержания жизнеспособных клеток до 91,72±0,44%. Более того, отмечено достоверное увеличени относительного содержания клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза (3,16±0,19% против 1,99±0,39% в контроле, р=0,024), а также погибших клеток (поздний апоптоз/некроз), когда результаты контрольных образов были превышение более чем в 4 раза (5,12±0,28% и 1,47±0,21%, соответственно, при р<0,001). Что касается серии экспериментов, в рамках которых веществот применятся в финальной концентрации 70 мкл, то было отмечено достоверное двукратное увеличение (р=0,009) клеток, находящихся на терминальных стадиях апоптоза и в некрозе (2,69±0,29%). Препарат в финальной концентрации 7 мкг/мл не оказывал достоверное влияние ни на один из исследованных показателей (рисунок 1., рисунок2.) 

Рис. 1. Поверхность, характеризующая зависимость ранней апоптической гибели клеток от концентраций веществ. Градиентная заливка поверхности позволяет оценивать отдельное и комбинированное действие препарата и камптотецина. Синим цветом обозначены области с низким процентом гибели клеток, а красным – области с высоким процентом гибели. 

Рис. 2. Поверхность, характеризующая зависимость поздней гибели клеток в результате апоптоза и некроза от концентраций веществ. Коричневым цветом обозначены области с низким процентом гибели клеток, а фиолетовым – области с высоким процентом гибели.

Внесение в среду для культивирования камптотецина, индуктора апоптоза, в финальной концентрации 1 мкМ сопровождалось снижением (р<0,001) относительного содержания жизнеспособных клеток до 31,58±1,68%, а также увеличением относительного содержания клеток на ранних и поздних стадиях апоптоза (до 30,12±1,94% и 38,30%, соответственно). Вместе с тем, в присутствие препарата в финальной концентрации 350 мкг/мл уровень жизнеспособных клеток увеличивался (р=0,001) и достигал значений в 45,11±2,17%. Более того, относительное содержание ТНР-1, находящихся на ранних стадия апоптоза снижалось до 21,49±2,15% (р=0,018), а клеток, находящихся на стадии позднего поптоза и некроза – до 33,40±2,49% (р=0,165). Внесение препарата в концентрациях 70 и 7 мкл/мл не оказывало достоверного влияния на распределение клеток по фазам апоптоза (рисунок 1., рисунок2.). В рамках отдельного эксперимента концентрация камптотецина в клетки была понижена до 0,2 мкМ, что привело к увеличению относительного содержания живых клеток до 47,76±3,17%, тогда как на ранних и поздних стадиях апоптоза находилось уже 20,75±2,40% и 31,49±1,31% клеток, соответственно. Инкубация ТНР-1 в присутствие камптотецина и препарата в финальной концентрации 350 мкг/мл достоверно не влияла на жизнеспособность клеток (51,11±1,49%, р=0,367), однако сопровождалась почти двукратным снижением относительного содержания клеток, находящихся на ранних стадиях апоптоза (до 12,86±2,00 при р=0,036). По остальным концентрациям препарата достоверных изменений жизнеспособности клеток линии ТНР-1 отмечено не было. 

Выводы

В результате проведенных исследований были получены данные о дозозависимом влиянии исследуемого вещества на жизнеспособность и процессы апоптоза клеток в культуре.

Более глубокое изучение механизмов репаративной регенерации ран кожи, в частности роли апоптоза, может собствовать поиску новых подходов к терапии, связанной с воздействием на иммунные механизмы регуляции гибели клеток и оценке эффективности применяемых лекарственных препаратов для профилактики образования рубцов. 

Список литературы

1. Gericke J., Ittensohn J., Mihály J., Alvarez S., Alvarez R., Töröcsik D., de Lera A.R., Rühl R. Regulation of RetinoidMediated Signaling Involved in Skin Homeostasis by RAR and RXR Agonists / Antagonists in Mouse Skin // PLoS One. 2013 Apr 24; 8(4): e62643.
2. Патент № 2481115 от 13.10.2011 Средство для заживления ран "Целльгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством.
3. Суховей Ю.Г., Костоломова Е.Г., Цирятьева С.Б., Аргунова Г.А., Унгер И.Г., Гольцов С.В. Регенераторно-репаративные и антибактериальные свойства препарата Cellgel в эксперименте//Российский Иммунологический Журнал, 2015, том9(18),№2(1).с 44-46.4.
4. Fuchs Y, Brown S, Gorenc T, Rodriguez J, Fuchs E, Steller H. Sept4/ARTS Regulates Stem Cell Apoptosis and Skin Regeneration. Science. 2013 Jun 20.
5. А.Д. Надеев, И.В. Кудрявцев, М.К. Серебрякова, П.В. Авдонин, В.П. Зинченко, Н.В. Гончаров. Индукция апоптоза и некроза клеток эндотелия пупочной вены человека пероксидом водорода // Цитология.- 2015.- Т.57. №12.- С.909-916.
6. Tallarida, R. J. Drug synergism and dose-effect data analysis / R. J. Tallarida. – CRC Press, 2000. – 264 p.
7. Khuri, A. I., Mukhopadhyay, S. Response surface methodology / A. I. Khuri, S. Mukhopadhyay // Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Statistics. – 2010. – Т. 2. – №. 2. – С. 128-149.