мои проекты
Фото Видео Блог Книги
Сергей Гольцов
борюсь с духовной и материальной нищетой
РУС | ENG

Фенотипическая дерматология

По результатам нескольких патентованных изобретений исследуется динамика состояний субпопуляций клеток кожи человека. Открывшиеся при этом иммунологические феномены меняют не только картину состояний кожи, но и представления о подходах к диагностике и лечению кожных заболеваний. Осмысление результатов исследований вызывает необходимость выхода к строгим формам мышления через мобилизацию методов концептуального анализа, применение которых обосновывает разнообразие потенциальных состояний субпопуляций клеток кожи. Этому способствует и то обстоятельство, что развитие иммунологии вскрывает новые свойства клеток, возникающие от разнообразных межклеточных отношений, направляя исследователей по пути их тщательного изучения, как причин симптомов тех или иных кожных заболеваний. Углубление концептуальных различений позволяет выйти на широкий класс исследовательских задач в дерматологии, опирающейся на различения фенотипов субпопуляций клеток кожи – фенотипическая дерматология. Дальнейшая концептуализация феноменологии состояний субпопуляций клеток кожи и ее динамики обнаруживает классы потенциальных ситуаций, которые до сих пор не различимы в дерматологии, а развертка родовых структур позволяет вывести до сих пор скрытые механизмы патологии кожи на эксплицитный уровень, давая возможность сменить парадигму подходов к диагностике и лечению заболеваний кожи.

Общая характеристика работы

Состоявшийся в 2017 году Совет при Президенте РФ по стратегическому развитию и приоритетным проектам обозначил главные критерии результативности сферы здравоохранения – точная и быстрая диагностика, действенное лечение, доброжелательное, человеческое отношение к пациенту, доступность, качество и эффективность лекарственных препаратов.

По своей распространенности, заболевания кожи входят в первую пятёрку среди всех болезней. Заболеваемость болезнями кожи остаётся на достаточно высоком уровне – среди взрослого населения это каждый 25-й человек в Российской Федерации и каждый 15-й ребёнок. В абсолютных числах, в 2016 году, было зарегистрировано 8 604 183 случая заболеваний кожи и подкожной клетчатки, при этом 6 240 955 случаев заболеваний были зарегистрированы впервые (Кубанова А. А. с соавт. 2017).

 

Наряду с этой информацией, определяющей безусловную социальную и экономическую значимость заболеваний кожи в жизни населения страны, развитие современной дерматологии не представляется возможным в отрыве от новых технологий, благодаря которым эта наука, изучающая кожу человека, интегрируется в самые сложные формы деятельности человека.

При этом, продолжающаяся модернизация российского здравоохранения ориентирована на развитие высокотехнологичных и высокоэффективных методов диагностики и лечения, а также оперативное внедрение научных разработок в практическое здравоохранение (Скворцова В.И., 2011; Стародубов В.И., 2012.). Дерматология, в этом случае не исключение. К 2018 году уже созрела необходимость разработки методов, в полной мере отвечающих рекомендациям великого русского клинициста Мудрова М.Я., который ещё два столетия назад утверждал необходимость «лечить больного, а не болезнь».

Представителями отечественной и зарубежной школ дерматологии уже многое сделано для обеспечения объективных представлений о морфофункциональных особенностях кожи человека (Мордовцев В.Н. с соавт, 1992; Ямщиков Н.В. с соавт., 2005; Мяделец О.Д. с соавт., 2006; Вулф К. с соавт., 2007; Резайкин А.В. с соавт., 2009; Штиршнайдер Ю.Ю. с соавт., 2011; Афанасьев Ю.И. с соавт., 2012; Баринов Э.Ф. с соавт., 2012; С. С. Кряжева с соавт., 2015; Антонова О.В. с соавт., 2016).

Как важнейшая барьерная ткань она является самостоятельным органом иммунной системы. Обладая разнообразием коопераций иммуннокомпетентных клеток, она функционирует в виде совокупности иммунологических реакций, которые проявляются в морфологических изменениях кожи, видимых невооруженным глазом (Боровик Т.Э. с соавт., 2009; Афанасьев Ю. И. с соавт., 2012).

 

Учитывая это, а также тот факт, что визуально различимые картины патологии кожи являются лишь следствием сложнейшего комплекса межклеточных взаимодействий, изучение фенотипа образующих ее клеток её является актуальной задачей дерматологии (Антонова О. В., с соавт., 2016). По причине обусловленности уникальной структурой связей клеток кожи, препятствующих разделению и изучению клеток по отдельности in vitro в жизнеспособном состоянии, эта задача оказывается чрезвычайно сложной.

 

Длительное время единственным способом получения объективной информации о морфофункциональном состоянии клеток кожи оставалась инцизионная биопсия, инвазивность которой, по мнению Шливко И.Л., (2014), значительно ограничивала её применение и практически исключала динамические наблюдения. Вместе с тем, этот же автор отмечает, что современная дерматология испытывает настоятельную потребность в прижизненных методах морфофункционального исследования кожи, поиски которых еще продолжаются, а основным методом оценки состояния кожи по-прежнему остается визуальный осмотр. Но, только ли?

Парадоксальным видится то, что известные методы исследования кожи, будь то неинвазивные – корнеометрия, себуметрия, кутометрия, профилометрия, ультрасонография, конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, оптическая когерентная томография, ультразвуковая микроскопия, магнитно-резонансная томография или инвазивные – гистологические методы (Зимняков Д.А с соавт., 2002; Золотенкова Г.В. с соавт, 2015; Кузимина Т.С. с соавт., 2009; Резайкин А.В. с соавт, 2009; Агафонова С.Г. с соавт., 2010; Каменский В.А., 2011; Лукашева Н.Н. с соавт.,  2012), при всей своей убедительности и достоверности в решении отдельных задач дерматологии, не готовы к оценке экспрессируемых клетками молекул, а следовательно и к оценке динамики изменений состояний субпопуляций клеток кожи. Перечисленные методы, описывая ряд свойств кожи, не учитывают того, что кожа – экзоорган, на который постоянно действует окружающая среда и в котором постоянно происходит сложный комплекс межклеточных взаимодействий (Ткаченко С.Б., Потекаев Н.Н., 2003). 

Наблюдаемая неразличимость состояний кожи на клеточном уровне, оценка клеток фиксированных гистологическими методами, не позволяет дерматологам современности в полной мере оценить динамику заболевания кожи, степень реагирования кожи на воздействия среды, функциональную активность клеточных субпопуляций кожи в условиях нормы и патологии, объективизировать критерии возрастных изменений кожи и оценить эффективность применяемых наружных лекарственных и косметических средств.

По сути, экстенсивное развитие дерматологии сформировало приверженцев двух крайностей в исследовании кожи.

Одни авторы актуализируют инвазивные методы, позволяющие исследовать кожу на клеточном уровне, вместе с тем не имея возможности оценивать функцию клеток, поскольку работают с фиксированными (мёртвыми) клетками. Другие – сторонники неинвазивных методов, хоть и опираются на возможность проводить исследования кожи и её функций, но на тканевом, а не клеточном уровне – там, где открывается колоссальный объем воспалительных реакций, определяющих состояние кожи, как органа иммунной системы. Порочный круг замкнулся.

 

Наблюдаемое состояние дерматологии, усугубляемое увеличением разнообразия заболеваний кожи, коморбидностью и отстающей скоростью развития методов диагностики, является отражением слабости дерматологии как теории. В рамках существующей парадигмы дерматологии, опирающейся на визуальную диагностику, сдержанно и ограничено использующей углубленные методы клеточной диагностики, не возникают новые концептуальные проблемы, которые бы выступали мотивами для ее развития, а не только совершенствования.

Дерматология движется в русле поиска однотипных лечебных средств универсально удовлетворяющих практику. Очевидно, это приносит улучшение показателей, но и одновременно свидетельствует о том, что сама парадигма исчерпала себя.

При этом технологизация и развитие смежных с дерматологией областей медицины (иммунология, цитология) стимулирует технологическое обновление дерматологии (Белова О.В. с соавт., 2014; Shapiro H.M., 2003). 

 

Так, на основе метода проточной цитометрии стало возможным определять не только количественные параметры популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный состав, с высокой точностью оценивая и функциональные свойства клеток иммунной системы (Хайдуков С.В., 2008). 

Вместе с открытием способа получения цитоиммунограмм кожи, отражающих состояние и функциональность её клеток (Гольцов С.В. с соавт., 2016, 2018), это породило возможность детального изучения клеточных субпопуляций не только периферической крови, но и кожи. 

Технические возможности проточной цитометрии, позволившие анализировать и идентифицировать любое количество клеток и их субпопуляций, а также измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивая их функциональное состояние (Shapiro H.M. 2003), вместе с запросом врачей-дерматологов в более строгом различении патологических процессов на клеточном уровне, обязывают к методологической стандартизации открывшихся диагностических возможностей.

В свою очередь это уже привело к появлению новых вопросов к дерматологии, на которые существующая научная парадигма ответов не дает:

  • О каком состоянии кожи свидетельствуют те или иные составы клеток всех видов в конкретном образце ее биоптата?
  • Каково полное разнообразие признаков клеток всех видов?
  • Какие комбинации признаков клеток каждого вида создают в коже те или иные функции?
  • Каков полный состав возможных функций клеток кожи, возникающих в разнообразии комбинаций всех признаков клеток всех видов?
  • Какие функции возникают у тех или иных видов клеток при активации их конкретных долей в составе конкретного биоптата кожи?
  • Может ли клетка каждого вида выступать одновременно в функционально разных состояниях и в каких?
  • Существуют ли ограничения на возникновение субпопуляций клеток, образующих ее различные клеточные фенотипы?
  • Каковы свойства клеточных фенотипов, образованных объединением определенных долей клеток каждого вида со своими функциями?
  • Какую структуру клеток, их признаков, функций, распределения долей клеток следует брать в качестве «единицы» измерения состояния кожи для ее прагматичного использования в исследовательской и лечебной практиках дерматологии будущего?

По мере расширения пространства этих вопросов объективно возникают трудности, связанные с использованием знаний о разнообразии функциональных состояний клеточных фенотипов кожи в диагностической и лечебной практике, с подходами к измерению этого разнообразия и подходами к разработке методов лечения. Эти и подобные вопросы обнажают проблему, которая формулируется следующим образом: 

как возможно увидеть и понять картину состояний кожи, открывающуюся на уровне исследования ее клеточных фенотипов, с практическим и теоретическим использованием знания о последствиях динамики ее клеточного разнообразия?

Эта проблема является проблемой концептуального значения, по отношению к которой еще не ясно как о ней думать, чтобы решать.

что можно назвать «дефицитом концептов для различения и объяснения новой реальности». Это обстоятельство побуждает к формированию фронта новых понятий относительно состояний кожи и к поиску методов порождения смыслов для дерматологии нового типа – фенотипическая дерматология.

Разрешение обозначенной научной проблемы дерматологии, обратившейся к клеточному уровню исследований состояний кожи, предлагается вести на основе инструментария концептуального научного-технического направления (Никаноров С.П., 1970-2018) и построенных на его основе технологий.

 

Все они ориентированы на инструментальный анализ, конструирование, синтез понятий в тех областях практики, которые нуждаются в концептуально строгих различениях реальности (Теслинов А.Г., 2009). Применение этого аппарата позволяет теоретически развить результаты практических экспериментов по исследованию состояний кожи с помощью проточной цитометрии. Особенно актуальным это становится в процессах модернизации здравоохранения РФ.

Объектом исследования в настоящей работе являются состояния кожи человека, определенные на уровне субпопуляций клеток.

Предмет исследования – свойства субпопуляций клеток кожи человека, определяющие их фенотипическое разнообразие.

Цель работы – концептуально обосновать применение проточной цитометрии для оценки фенотипического разнообразия клеток кожи человека.

Научная гипотеза состоит в том, что проблема будет решена, если:

  • В качестве «единицы» разнообразия состояний кожи на клеточном уровне будет взят фенотип субпопуляций клеток кожи, представляющий собой их особенную, отличную от других совокупность клеток элементарного фрагмента кожи, образующую специфическую функциональную структуру из клеток одновременно всех видов;
  • Теория, объясняющая состояния кожи на уровне ее фенотипов, будет построена на основе инструментария, оперирующего понятиями (концептами) и пригодного для выведения логически строгих следствий из результатов экспериментальных исследований кожи на клеточном уровне; 
  • Подход к построению теории будет основан на разработке и синтезе полей понятий для определения состояний кожи в статике; переходов состояний кожи; переходов состояния кожи, обусловленных различными видами искусственного и естественного вмешательства в нее на клеточном уровне;
  • Ряд концептуальных конструкций образующейся теории будет проверен экспериментально в ходе диагностики состояний кожи на уровне фенотипов субпопуляций ее клеток и на этой основе могут быть получены практические результаты, значимые для развития лечебной практики;
  • Из построенного концептуального пространства теории будут выведены новые классы задач, развивающие дерматологию с темпом, опережающим скорость фронта усложнения патологии кожи.

Для подтверждения этой научной гипотезы и достижения цели в работе поставлен ряд следующих задач, которые были решены в ходе исследования:

  1. Провести анализ современного состояния дерматологии и обосновать проблемы, возникающие с появлением цитоиммунограмм кожи.
  2. Обосновать концептуальную «единицу» разнообразия состояний кожи на клеточном уровне.
  3. Определить фенотип субпопуляций клеток кожи человека.
  4. Разработать способы получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограмм кожи.
  5. Обосновать подход к построению поля концептов, определяющих полное разнообразие субпопуляций клеток кожи для проведения углубленных научных исследований клеток кожи человека и разработать эти концепты.
  6. Экспериментально продемонстрировать практическую полезность использования проточной цитометрии и построенных концептов в исследовании свойств субпопуляций клеток кожи и применения в диагностической и лечебной практике.
  7. Разработать критерии применения проточной цитометрии для диагностики в дерматологии.
  8. Разработать диагностическую панель для исследования отдельных субпопуляций клеток кожи.
  9. В качестве практического примера разработать средство для заживления ран, способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством.
  10. В качестве примера практической преемственности разработать устройство для активации репаративных потенций клеток кожи.
  11. Сформулировать новые научные задачи на разработку методов прогнозирования, диагностики и лечения заболеваний кожи.

Теоретико-методологическую основу исследования и решения сформулированных задач составляют достижения современной цитологии, иммунологии, дерматологии, системологии и концептологии.

При решении поставленных задач и проверке научной гипотезы использовался комплекс дополняющих друг друга методов исследования: метод 3D-визуализации и измерения структур кожи, методы себуметрии, корнеометрии, кутометрии, профилометрии, punch-биопсии, механической гомогенизации тканей, метод проточной цитометрии, метод криоконсервации тканей, метод системного анализа, метод концептуальной расчистки сложных предметных областей, метод двухколенного восхождения от эмпирического конкретного к теоретически конкретному через абстрактное, метод родоструктурной экспликации понятий, методы исчисления высказываний и другие.

Научная новизнаполученных результатов исследованиясостоит в следующем:

  1. Впервые показана возможность количественной, морфологической и функциональной оценки жизнеспособных клеток кожи методом проточной цитометрии.
  2. В ходе экспериментов впервые получены цитоиммунограммы кожи, позволяющие исследовать и отображать в цифрах субпопуляционный состав клеток кожи и их функциональную активность. Способ получения цитоиммунограмм впервые позволил дать прижизненную характеристику морфофункциональному состоянию клеток кожи человека в пределах одного биоптата.
  3. Впервые предложена и внедрена диагностическая панель наборов моноклональных антител к различным кластерам дифференцировки, наиболее точно характеризующих динамику состояний субпопуляций клеток кожи: 
    • кератиноциты CD49f+, из них активированные CD49f+HLA-DR+; 
    • фибробласты (фиброциты) CD45-CD14-CD44+, из них активированные CD45-CD14-CD44+CD80+; 
    • тучные клетки CD249+, из них активированные CD249+CD63+; 
    • моноциты (макрофаги) CD45+CD14+, из них активированные CD45+CD14+HLA-DR+; 
    • внутриэпидермальные макрофаги CD207+, из них активированные CD207+CD80+, CD207+HLA-DR+, CD207+CD80+HLA-DR+; 
    • эндотелиальные клетки CD146+, из них активированные CD146+CD34+, CD146+HLA-DR+, CD146+CD54+, CD146+CD54+HLA-DR+; 
    • эпителиальные клетки CD34+CD45dim; 
    • лимфоцитарные популяции: Т-лимфоциты CD45+CD3+, Т-хелперы CD45+CD3+CD4+CD8-, Т-супрессоры CD45+CD3+CD4-CD8+, В-лимфоциты CD45+CD3-CD19+, NK-лимфоциты CD45+CD3-CD16+CD56+.
  4. Впервые показано, что в качестве концептуальной «единицы», объясняющей разнообразие состояний кожи, необходимо взять фенотип субпопуляций. Фенотип субпопуляции представляет собой особенную, отличную от других субпопуляцию, состоящую из клеток кожи одного вида и имеющую специфическую функционально-клеточную структуру элементарного фрагмента кожи. Переход от симптоматического подхода в исследовании кожи и лечении заболеваний кожи к фенотипическому является переходом к дерматологии нового типа, в основе которой должны быть положены механизмы цитоиммунологии, способной исследовать и использовать знания о свойствах всех возможных фенотипов субпопуляций клеток кожи.
  5. Впервые предложен инструментарий для построения представлений о разнообразии фенотипов субпопуляций клеток кожи. Инструментарий основан на синтезе методов экспериментальной дерматологии и иммунологии, технологически поднявшихся на уровень изучения и оперирования комплексами клеток кожи, с методами концептуального анализа результатов экспериментов. Эта идея показала свою продуктивность в порождении большого количества классов новых понятий в дерматологии. 
  6. Впервые разработан подход к построению понятий о фенотипах субпопуляций клеток кожи, определяющих их разнообразие и динамику. Подход основан на том, что с помощью концептуальных методов эксплицированы три предметные области, расставленные в логике усложнения и одновременно углубления различений особенностей фенотипически возможных состояний кожи: 
  • Феноменология состояний кожи в статике. 
  • Феноменология переходов состояний кожи (динамика состояний). 
  • Феноменология обусловленных переходов состояний кожи. 

Построенные концепты выделенных предметных областей позволили различать и исследовать свойства всего разнообразия компонентов, из которых образуется реальная картина состояний кожи. Результаты концептуальной экспликации позволили обнаружить классы потенциальных ситуаций, которые до сих пор не были различимы в дерматологии и не являлись предметом изучения и использования в диагностической и лечебной практике дерматолога. 

7. Экспериментально подтверждена возможность использования проточной цитометрии и концептуально построенного разнообразия фенотипов субпопуляций клеток для повышения качества диагностики в дерматологии и задействования полученного знания в процессы диагностики и лечения патологии кожи. В виде воплощения терма концептуально построенной теории  разработано устройство для избирательной активации in vitro клеток кожи определенного фенотипа в виде амплификатора репаративных потенций клеток кожи. Этот результат открыл возможность для создания ряда решений по так называемой «адресной доставке» активных веществ. На основе полученной возможности управляемой активации репаративных потенций разработано и внедрено в практику средство для заживления ран, способ его получения и способ лечения ран различной этиологии.

8. Сформулирован ряд научных задач фенотипической дерматологии относительно подходов к исследованию состояний кожи на разработку методов прогнозирования, диагностики и лечения заболеваний кожи.

разработаны концептуальные основания теории фенотипического разнообразия клеток кожи человека, обеспечивающие интенсивный переход к развитию исследовательской и лечебной практики в дерматологии. Это стало возможным в результате синтеза современных положений дерматологии и иммунологии, осмысленных посредством концептуальных методов.

 

Практическая значимость полученных результатов:

  • Экспериментальные результаты изучения состояний клеток кожи, сохраняющих свою жизнеспособность, открывают фронт исследований, который объективно приведет к расширению опытного знания в дерматологии. Предложенный переход к междисциплинарному подходу изучений состояний клеток кожи человека, опирающийся на достижения иммунологии, цитологии и дерматологии имеет практическое значение для всех этих отраслей научного знания. 
  • Разработанный подход к анализу экспериментальных данных, основанный на задействовании методов концептуального анализа и синтеза сложных предметных областей, открывает возможность для интенсивного развития дерматологии как теории с фронтом решений сложных проблем и задач, опережающим динамику развития патологии кожи. 
  • Результаты концептуализации феноменологии состояний кожи на клеточном уровне могут привести к кратному увеличению точности диагностики состояний кожи, поскольку они могут исследоваться не по морфологической картине ее патологических симптомов, определяемых визуальным осмотром, а по особенностям различимых субпопуляций клеток ее конкретного участка, измеряемых инструментально. Такого рода переход от симптоматического подхода в исследовании кожи и лечении заболеваний кожи к фенотипическому является переходом к дерматологии другого, нового типа – к фенотипической дерматологии, создающей образец (парадигму) глубокого проникновения в природу кожных заболеваний и возможностей, граничащую с цифровыми технологиями. При такой исследовательской парадигме состояния кожи могут быть рассчитаны. Это обстоятельство имеет значение для выведения дерматологии на уровень прогноза развития патологий, существенно опережающих фронт естественной эволюции кожных заболеваний. 

Положения к защите теории:

  1. Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, позволяет разделить клетки кожи с сохранением их жизнеспособности для дальнейших диагностических исследований, выделения и культивирования отдельных популяций, а также подбора, испытания и разработок лекарственных препаратов для лечении заболеваний кожи.
  2. Технический результат, включающего в себя забор биоптата кожи, гомогенизацию ткани, фильтрование гомогената, центрифугирование гомогената, определение жизнеспособности клеток, инкубирование клеток с моноклональными антителами, конъюгированными с флюорохромами, фенотипирование клеток кожи с определением количества клеток определенного фенотипа – является способом определения субпопуляционного состава клеток кожи и методом получения цитоиммунограмм кожи.
  3. Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи позволяет проводить количественную и функциональную оценку состояния субпопуляций жизнеспособных клеток кожи в различных поло-возрастных группах пациентов и устанавливать корреляцию структурных и функциональных параметров исследованных клеток.
  4. В качестве «единицы», объясняющей разнообразие состояний кожи на клеточном уровне, необходимо рассматривать фенотип субпопуляций. Он представляет собой субпопуляцию, состоящую из клеток кожи одного вида, имеющую отличительную (специфическую) функционально-клеточную структуру элементарного фрагмента кожи. Эта «единица» исследования  позволяет различать субпопуляции клеток со всеми разнообразными активностями функций, включая и те, в которых все виды клеток одновременно проявляют все свои функции. На основе различения свойств конкретных фенотипов субпопуляций могут ставиться новые классы задач на исследования ситуаций здоровья/болезни. 
  5. Эффективным инструментом развития теоретического знания о состояниях кожи, полученного на основе экспериментальных данных, должен быть тот, что основан на синтезе методов экспериментальной дерматологии и иммунологии с методами концептуального анализа и синтеза сложных предметных областей. Этот синтез позволяет логически строго формировать и представлять для биофизических исследований в явном виде понятия о полном разнообразии состояний кожи, различимых на клеточном уровне.
  6. Рациональный подход к построению понятий о фенотипах субпопуляций клеток кожи, определяющих их разнообразие и динамику состоит в последовательной экспликации результатов экспериментов в виде разработки родовых концептуальных схем феноменологии состояний кожи в статике, феноменологии переходов состояний кожи (динамики); феноменологии переходов состояний кожи, обусловленных различными видами вмешательства и последующего синтеза этих концептуальных схем. Такой подход позволит порождать множество концептов, позволяющих различать и исследовать свойства всего разнообразия компонентов, из которых образуется реальная картина состояний кожи. 
  7. Концепты фенотипов субпопуляций клеток кожи и других явлений, связанных с ее состояниями, должны быть использованы в качестве заданий на постановку экспериментов по исследованию свойств кожи, ведение разработок по созданию диагностических и лечебных устройств и препаратов, постановку новых классов исследовательских задач. Углубление концептуальных различений состояний субпопуляций клеток кожи и ее динамики в виде развертки родовых структур этой динамики и интерпретации термов формальной теории позволит выводить скрытые обстоятельства патологии кожи на эксплицитный уровень и создавать новые средства лечения кожных заболеваний.
  8. Устройство для активации репаративных потенций клеток кожи, позволяет избирательно активировать in vitro клетки кожи определенного фенотипа.
  9. Изобретение средства для заживления ран кожи «Цельгель», способа его получения и способа лечения ран различной этиологии полученным средством позволяет создать эффект управляемого ранозаживления, обеспечив сокращение его сроков и закрытие дефекта ткани с восстановлением функции.
  10. Развивающие направления дерматологии, использующей в качестве «единиц» исследования состояний кожи фенотипы субпопуляций ее клеток, могут порождаться не в виде озарений талантливых исследователей, а в виде постановки задач на выявление биофизических свойств  методично выводимых видовых концептов формальных теории, образованных построенными родоструктурными концептуальными схемами. Такого рода способ работы с неизвестным в дерматологии создаст поле перспективных исследований, на годы опережающих эволюцию патологии кожи.
  11. Когнитивные возможности изучения фенотипов субпопуляций клеток кожи и специфические правила их исследования образуют новую область медицины, которую следует назвать фенотипической дерматологией. Переход к ней позволит усилить интеллектуальную мощность парадигмы диагностики и лечения заболеваний кожи.

По теме работы опубликовано 17 научных работ, в том числе 11 статей в научных журналах из перечня ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, 4 патента, 2 монографии.

 

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Первая глава посвящена аналитическому обзору работ современных и зарубежных авторов.

В ходе анализа выявлены существующие противоречия в дерматологии. Точнее, её дальнейшем развитии, как практики. Опираясь в получении объективной информации о морфологическом состоянии кожи на инцизионную биопсию, инвазивность которой значительно ограничивает её применение, современная дерматология испытывает настоятельную потребность в прижизненных методах морфофункционального исследования кожи, поиски которых еще продолжаются, а основным методом оценки состояния кожи по прежнему остается визуальный осмотр. Развитие методов исследования кожи, будь то неинвазивные – корнеометрия, себуметрия, кутометрия, профилометрия, ультрасонография, конфокальная сканирующая лазерная микроскопия, оптическая когерентная томография, ультразвуковая микроскопия, магнитно-резонансная томография или инвазивные – гистологические методы, при всей своей убедительности и достоверности в решении отдельных задач дерматологии, не решают вопросов различимости состояний кожи на клеточном уровне, а оценка клеток фиксированных гистологическими методами (не жизнеспособных клеток) не позволяет дерматологам современности в полной мере оценить динамику заболевания кожи, степень реагирования кожи на воздействия среды, функциональную активность клеточных субпопуляций кожи в условиях нормы и патологии, объективизировать критерии возрастных изменений кожи и эффективность применяемых наружных лекарственных и косметических средств. В подтверждении этого, проведен анализ современных достижений в области иммунологии и цитологии. 

Проточная цитометрия – метод измерения характеристик клеток появилась в результате синтеза знаний о традиционных гистохимических и цитохимических методах анализа. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.д. Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики:

- во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу;

- во-вторых, это способность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10–5-10–7. Так, современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 100 000 клеток в секунду (Хайдуков С.В., 2008).

Информация, извлекаемая методом проточной цитометрии, позволяет исследователям судить о морфологических характеристиках клеток (размере, отношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток). В свою очередь, это привело к возможности типировать клетки без применения флуоресцентных красителей, что особенно ценно при работе с периферической кровью. Данный подход позволяет разделить и расположить в виде гистограммы клетки периферической крови (Bossuyt X. et al., 1997).

Развитие технологии привело к тому, что у исследователей появился в руках ещё и такой инструмент, как моноклональные антитела, предоставившие возможность типировать клетки не только благодаря их морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для определенных клеток и их функционального состояния (Leucocyte typing VI., 1997). Сегодня, известно 339 кластеров дифференцировки (Cluster of Differentiation, CD) клеток человека (Zola H., et al., 2005).

Одновременно были выявлены вызовы к дерматологии, исходящие от усложнения кожных патологий, сопровождающиеся значительными изменениями клеток кожи и их функций. Это выражается как в изменении количества клеток, так и в появлении на их поверхности определенных функциональных молекул, в своей совокупности характеризующих определенные клинические состояния.

Таким образом, в первой главе сформулирована научная проблема исследования. Обоснованы объект исследования, предмет и цель исследования. Сформулированы задачи исследования и предложена научная гипотеза их решения.

Во второй главе

отражены результаты экспериментальных исследований кожи на клеточном уровне. 

Экспериментальное построение цитоиммунограмм кожи проводилось инвазивным способом, включающим в себя забор биоптата кожи на глубину 2 мм с ягодичной области человека с помощью инструмента для биопсии DERMO-PUNCH 2 мм (STERYLAB, Италия). Биоптат кожи и 1 мл 0,9 % водного раствора хлорида натрия помещался в рабочую камеру автоматической системы для механической гомогенизации ткани Medimachine (Becton Dickinson, США). 

Гомогенизация ткани проводилась в течение 30 секунд при температуре +23°С. Гомогенат извлекался стерильным шприцем. Рабочая камера гомогенизатора трижды вымывалась 0,9% водным раствором хлорида натрия по 1 мл. Гомогенат фильтровался через фильтр для клеток Falcon (Becton Dickinson, США) с нейлоновой сетчатой структурой и диаметром пор 20 мкм. Далее гомогенат центрифугировался для удаления надосадочной жидкости при 400 g в течение 5 минут при температуре + 23°С.

После этого, определялась жизнеспособность клеток с помощью внутриклеточного  красителя 7-amino-actinomycin D RUO (7AAD) (Beckman Сoulter, США). Анализ проводился на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США). Идентификация клеток выполнялась путем регистрации двух параметров: бокового светорассеяния (side scatter) и регистрацией флюоресценции по 3 каналу (FL3). 

Полученный образец кожи исследовался ex tempora, либо после длительной криоконсервации. Для этого, проверенный на стерильность образец помещался в криопробирку Costar 2 мл. с раствором для замораживания (90% Fetal Bovine Serum и 10% DMSO в качестве криопротектора), затем образец замораживался в парах жидкого азота t°-140°C со скоростью 1°C в минуту, методом витрификации.

Клетки кожи инкубировались в течение 20 минут в защищенном от света месте с моноклональными антителами, конъюгироваными с флюорохромами флюоресцеинизотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ), PE – Texasred (ESD), PE/CY5(PC5), PE/CY7(PC7) (Beckman Сoulter, США). 

Методом проточной цитофлуорометрии проводилось фенотипирование клеточной суспензии на проточном цитофлюориметре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США) используя специфические маркеры: CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD19, CD34, CD44, CD45, CD49, CD54, CD63, CD80, CD146, CD203c; CD207, CD249 с помощью которых идентифицировались субпопуляции клеток и определялся их фенотип.

Была определена диагностическая панель маркеров дифференцирования клеток, наиболее точно характеризующих динамику состояний субпопуляций клеток кожи: 

  • кератиноциты CD49f+, из них активированные CD49f+HLA-DR+; 
  • фибробласты (фиброциты) CD45-CD14-CD44+, из них активированные CD45-CD14-CD44+CD80+; 
  • тучные клетки CD249+, из них активированные CD249+CD63+; 
  • моноциты (макрофаги) CD45+CD14+, из них активированные CD45+CD14+HLA-DR+; 
  • внутриэпидермальные макрофаги CD207+, из них активированные CD207+CD80+, CD207+HLA-DR+, CD207+CD80+HLA-DR+; 
  • эндотелиальные клетки CD146+, из них активированные CD146+CD34+, CD146+HLA-DR+, CD146+CD54+, CD146+CD54+HLA-DR+; 
  • эпителиальные клетки CD34+CD45dim; 
  • лимфоцитарные популяции: Т-лимфоциты CD45+CD3+, Т-хелперы CD45+CD3+CD4+CD8-, Т-супрессоры CD45+CD3+CD4-CD8+, В-лимфоциты CD45+CD3-CD19+, NK-лимфоциты CD45+CD3-CD16+CD56+.

Для регистрации получаемых результатов и удобства пользования разработан бланк медицинского документа «Цитоиммунограмма кожи», в котором представлен состав клеток кожи, с указанием фенотипа каждой субпопуляции для заполнения лаборантом числовых данных в относительных и/или абсолютных единицах по результатам исследования. 

Для демонстрации возможностей использования цитоиммунограммы кожи ex tempora и после криоконсервации, было отобрано 64 условно здоровых лиц, которых поделили на группы по полу и возрасту 25-45 лет и 45- 65 лет, по 16 человек в каждой. Исследование состояло из двух этапов: 

1 этап – исследовался биоптат с ягодичной области патентованным способом; 

2 этап – определение фенотипа клеток из нативного и криоконсервированного образцов. 

В качестве примера функциональной оценки субпопуляций клеток кожи, сопряженной с физикальной, продемонстрировано наблюдение количества кератиноцитов и фибробластов в исследуемых образцах:

1 этап – анкетирование 64 участников исследования и деление их на группы. 

2 этап – оценка состояния кожных покровов методами себуметрии, корнеометрии, кутометрии, профилометрии. Использовалась оптическая система для 3D-измерения структуры кожи PRIMOS компании GFMesstechnic GmbH, и прибор Multi Probe Adapter Cutometer® MPA 580, включая датчик Corneometer® CM 825 для измерения влажности кожи, оптическую систему Sebumeter® SM 815.

3 этап – исследовался биоптат с ягодичной области патентованным способом – цитоиммунограмма кожи.

4 этап  - проводилась оценка достоверности показателей в группах сравнения.

 

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась дискриптивными методами и представлена в виде средней арифметической и её стандартной ошибки (M±m). 

Изобретение цитоиммунограммы кожи позволило открыть путь к новому пониманию процессов, проходящих в коже человека на уровне субпопуляций клеток и дало возможность количественно и функционально оценить показатели состояния кожи.

Наблюдение первое – частный случай оценки состояния кожи человека

С помощью инструмента для биопсии осуществлён забор биоптата кожи человека с ягодичной области. После пробоподготовки, описанной выше, методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, USA) определяли количество жизнеспособных клеток кожи (рис. 1), что составило 94%.

Рисунок 1. Результат оценки жизнеспособности клеток кожи в образце на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США)

Также регистрировали количество клеток определенных фенотипов, используя наборы моноклональных антител меченые флюорохромами и связывающиеся с определёнными рецепторами на мембране клетки (рис. 2). Показано, что в образце кожи 54,2% кератиноцитов, из них в состояниии активности 41,4%.

Рисунок 2. Пример результата фенотипирования суспензии клеток кожи человека – кератиноциты (фенотип CD49f+) на проточном цитометре Cytomics FC500 (Beckman Сoulter, США) 

Общие результаты исследованной суспензии клеток всех типов фиксировали на бланке (рис. 2).

Рисунок 3. Результаты цитоиммунограммы кожи на бланке

Приведенные, в качестве демонстрации возможностей проточной цитометрии в дерматологии, результаты обследования одного условно здорового обследуемого показывают, что в данном образце кожи:

  1. активно представлена субпопуляция кератиноцитов, причем большинство из них активированы, что говорит об умеренной пролиферативной активности базального слоя эпидермиса;
  2. присутствуют B-лимфоциты, которые в норме являются резидентами циркулирующего объема крови и лимфы, поскольку имеют положительный таксис к высоко-эндотелиальным венулам, находящимся преимущественно в лимфатических узлах. Наличие их в коже указывает на активность гуморального иммунитета;
  3. присутствие несколько разновидностей T-лимфоцитов (CD3+ лимфоцитов), локализующихся преимущественно в трех наружных слоях эпидермиса, и тот факт, что CD4+ клетки несколько превалируют численно над CD8+ клетками, говорит об усилении адаптивного иммунитета кожи;
  4. низкое содержание Т-супрессоров свидетельствует об отсутствии инфекционно-воспалительного процесса;
  5. остальные показатели демонстрируют количество специфических клеток кожи, но при этом их низкую активацию, что в совокупности с отсутствием специфических жалоб у данного пациента свидетельствует о нормальном состоянии его кожи.

 

Наблюдение второе – сравнительная оценка цитоиммунограммы кожи нативных и криоконсервированных образцов

Для демонстрации возможностей использования цитоиммунограммы кожи, из 64 обследуемых, выделены группы по полу и возрасту 25-45 лет и 45-65 лет, по 16 человек в каждой. Деление обследованных по полу и возрасту было необходимым, чтобы показать различие измеряемых параметров в разных половозрастных группах. В результате исследования, впервые из общей гетерогенной популяции клеток кожи были получены отдельные субпопуляции и определен фенотип клеток, из нативного и криоконсервированного образца (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительная оценка фенотипа клеток биоптата кожи из нативного и криоконсервированного образца 

 

Клеточный состав

кожи

Локализация

Фенотип

Нативный образец (%)

Размороженный

образец (%)

Кератиноциты

эпидермис

CD 49f+

70,25±3,75

68,2±2,01

Активированные кератиноциты

CD 49f+ HLA-DR+

3,25±0,75

1,3±0,04***

Фибробласты

дерма

CD 45-CD 14-CD 44+

76,5±3,5

66,8±4,0*

Активированные фибробласты

CD 45-CD 14-CD44+ CD80+

4,93±2,47

3,5±0,2

Эпидермальные

клетки Лангерганса

эпидермис

дерма

CD 207+

48±1,0

46,4±1,2

Активированные клетки Лангерганса

CD 207+CD80-HLA-DR+

CD 207+CD80+HLA-DR-

CD 207+CD80+HLA-DR+

3,8±0,9

5,1±1,1

0

0***

1,3±0,05***

3,5±0,9***

Эндотелиальные  клетки

дерма

CD 146+

1,32±0,98

0,6±0,03***

Активированные эндотелиальные

клетки

CD 146+CD 54- HLA-DR+

CD 146+CD 54+ HLA-DR-

CD 146+CD 54+ HLA-DR+

CD 146+CD 34+

0

22,88±2,52

0,33±0,17

6,93±1,07

0

50,0±4,6**

0*

36,0±5,2***

Тучные клетки

эпидермис

CD 249+

3,43±1,77

2,5±0,99

Активированные тучные клетки

CD 249+ CD 63+

1,1±0,2

1,6±0,3

Моноциты (Макрофаги)

дерма

CD 45+ CD 14+

7,75±1,25

5,6±1,01

Активированные моноциты (Макрофаги)

CD 45+ + CD 14+ HLADR+

0,23±0,16

0***

Эпидермальные лимфоциты

Т-общие

эпидермис

дерма

 

 

CD 45+ CD 3+

 

 

14,0±1,0

 

 

11,2±1,99

Т-хелперы

CD 45+ CD 3+ CD4+CD8-

11,0±1,0

9,9±0,75

Т-цитотоксические

CD 45+ CD 3+ CD4-CD8+

2,5±0,5

1,3±0,22*

В-лимфоциты

CD 45+ CD 3+ CD19+

6,0±1,0

7,0±1,05

NK-клетки

CD 45+ CD 3-CD16+CD56+

10,5±1,5

9,5±1,14

Достоверность различия по сравнению с нативным образцом * р<0.05; **p<0.01;***p<0.001

Жизнеспособность в нативном образце составила – 99,8%, после криоконсервации – 87,0%. При сравнение данных процентного соотношения клеток кожи двух образцов, существенного расхождения в показателях не обнаружено, за исключением клеток экспрессирующих на своей поверхности HLA-DR антигены и молекулы адгезии, то есть являющихся  антигенпрезентирующими.

Наблюдение третье – сравнительная характеристика количества кератиноцитов эпидермиса и фибробластов дермы

В качестве примера, демонстрация количества кератиноцитов и фибробластов в исследуемых образцах (табл. 2)

Таблица 2. Поло-возрастная количественная характеристика кератиноцитов эпидермиса и фибробластов дермы обследованного контингента

Возраст, лет

25-45

45-65

Кератиноциты эпидермиса (фенотип CD 49f+)

мужчины

69,9±0,96

58,5±1,18***

женщины

66,88±0,47

51,1±1,9***

Фибробласты дермы (фенотип CD 45-CD 14-CD 44+)

мужчины

74,25±1,1

63,9±1,0***

женщины

71,25±0,34

59,1±0,9***

Достоверность сравнения с контрольной группой: *  -  p<0,05; **  -  p<0,01; ***  -   p<0,001

Как видно, количество кератиноцитов в эпидермисе с течением времени уменьшается. Результаты достоверны в группах сравнения 25-45 и 45-65 у обоих полов, а так же в группах сравнения 25-45 и 45-65 между мужчинами и женщинами. Необходимо отметить, что у мужчин количество кератиноцитов в эпидермисе больше, чем у женщин на 4%. Это можно объяснить тем, что анатомически толщина кожи у мужчин выражена значительнее, чем у женщин. Причем, у мужчин количество кератиноцитов в эпидермисе с возрастом уменьшается на 16,3%, а у женщин на 23,6%. Такое снижение клеток, возможно связано с различием гормонального фона между полами.

Количество фибробластов в дерме также демонстрирует возрастное снижение. Результаты достоверны в группах сравнения 25-45 и 45-65 у обоих полов, а так же в группах сравнения 25-45 и 45-65 между мужчинами и женщинами. У мужчин количество клеток больше по сравнению с женщинами на 4%. Динамика снижения с возрастом – у мужчин количество фибробластов в дерме уменьшается на 13,9%, а у женщин – на 17%. 

В большей степени происходит снижение количества кератиноцитов в эпидермисе, чем фибробластов в дерме. Причем у женщин эти изменения более выражены с возрастом.

Представленные наблюдения не единичны и полученные результаты стоит определить точнее, но в данном случае они только демонстрируют новые диагностические возможности способа получения гетерогенной популяции клеток кожи человека (Патент RU 2502999 (Россия) от 25.07.2012) и способа определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи (Патент RU 2630607 (Россия) от 02.06.2016).

Изобретение цитоиммунограммы кожи позволило открыть путь к новому пониманию процессов, проходящих в коже человека на уровне субпопуляций клеток и дало возможность количественно и функционально оценить показатели состояния кожи.

Третья глава

посвящена разработке подхода к анализу экспериментальных результатов и построению концептуальных оснований теории, объясняющей состояния кожи на уровне клеточных субпопуляций, и разработке поля концептов этой теории.

Используя открывшиеся возможности исследования субпопуляций клеток кожи, предложен подход к решению концептуальных проблем дерматологии. Существо подхода состоит в следующем:

  1. В качестве основного инструментария анализа экспериментальных данных о состояниях и динамике клеточных субпопуляций выбрана технология,  оперирующая понятиями (концептами) на основе строгих математических методов и позволяющая выводить логически непротиворечивые следствия из утверждений и предположений, полученных опытным путем. Такой технологией является технология концептуального анализа и синтеза систем – отечественная школа мышления, развивающаяся как концептуальное научно-техническое направление с середины 70-х годов прошлого века (школа С.П. Никанорова). 

Основаниями для выбора концептуальных методов и технологии по отношению к обнаруженным проблемам дерматологии являются следующие:

  • Концепты, как единицы оперирования смыслами, используются в этих методах в неразрывной взаимосвязи двух своих существенных граней: объема понятий и содержания. А поскольку клеточный уровень исследования состояний кожи напрямую выводит к исследованию структур  субпопуляций клеток, образованных из различных множеств, то это дает шанс через исследование этих множеств как объемов стоящих за ними понятий выйти к содержанию этих понятий и концептуально различить все разнообразие состояний кожи;
  • Базовой логикой концептуальных методов является логика восхождения от наблюдаемого конкретного к мысленно абстрактному и через него – к порождению разнообразия мысленно конкретного. Это означает, что по ограниченному составу экспериментально полученных структур субпопуляций клеток может быть получено разнообразие всех теоретически возможных клеточных феноменов. Это позволит выйти к теоретически полной картине состояний кожи. Такая возможность концептуализации экспериментальных результатов открывает простор научным исследованиям, существенно опережающим  фронт развития дерматологических патологий;
  • Все операции над понятиями совершаются в концептуальной технологии инструментально. Для этого используются развитые в школе логико-математические средства: исчисление высказываний, математическая теория родов структур (Бурбаки Н., 1965) и аппарат ступеней множеств (Никаноров С.П., 2013). Это позволяет методично и строго выводить все логические следствия из результатов синтеза понятий. Такими следствиями являются новые понятия, которые не были очевидны в начале концептуализации и не могли появиться в ходе поставленных экспериментов. Возможность инструментально порождать новые понятия позволит, во-первых, существенно усилить результативность экспериментальной дерматологии, выводя из экспериментов следствия, далеко выходящие за границы опытов. Во-вторых, это придаст процессу появления новых теоретических результатов интенсивный характер.

2. Предложено концептуализацию экспериментальных феноменов проводить в трех предметных областях, построенных в логике усложнения и одновременно углубления различений особенностей состояний кожи:

  • Предметная область 1. Феноменология состояний кожи в статике. В границах этой предметной области могут быть получены концепты, определяющие полное разнообразие клеточных субпопуляций, разнообразие субпопуляций с различением в них разнообразия признаков клеток, состояний активности клеток, функций клеток в структуре конкретной пункционной биопсии кожи, структур функций субпопуляций и другие феномены, рассмотренные в статике.
  • Предметная область 2. Феноменология переходов состояний кожи (динамика состояний). В границах этой предметной области могут быть различены все виды смен состояний кожи, построена типология динамик состояний кожи, установлено разнообразие цепочек возможных переходов, структур цепочек и другие возможные феномены изменения состояний кожи.
  • Предметная область 3. Феноменология обусловленных переходов состояний кожи. В границах этой предметной области могут быть разработаны представления (понятия) о явлениях, возникающих при различных видах искусственного и естественного вмешательства в состояния кожи, в их динамику, о типологии вмешательств, о типологии теоретически возможных цепочках переходов между состояниями кожи, обусловленных вмешательствами и другие феномены практического влияния на кожу.

3. Выбрана исследовательская стратегия последовательного овладения этими предметными областями и теми, которые могут быть синтезированы из них. Это решение связано с двумя обстоятельствами. Во-первых, с тем, что результаты концептуализации одной, более простой предметной области, неизбежно окажут влияние не исходные представления, необходимые для постижения другой, более сложной. Во-вторых, параллельно работе с предметными областями будет развиваться и экспериментальная ветвь дерматологии, ориентированной на исследование цитоиммунологических свойств кожи.

Для построения ряда концептов в математическом аппарате родов структур, который задействуется в концептуальных методах, приняты следующие исходные предположения, выведенные из анализа результатов экспериментов с клетками кожи и полученных цитоиммунограмм:

  • В создании тех или иных феноменов состояния кожи участвует ограниченное разнообразие видов клеток;
  • Клетка каждого вида обладает определенным измеримым (обнаруживаемым) составом признаков. Количество признаков ограничено;
  • Клетки каждого вида могут проявлять (могут не проявлять) одну или сразу несколько различных функций. Это определяется составом (комбинацией) признаков клеток;
  • Количество потенциально возможных функций каждой клетки определяется всеми комбинациями всех ее признаков;
  • Клетки объединяются в субпопуляции. В каждой субпопуляции участвуют клетки каждого вида со своими разными функциями. Ограничения на разнообразие так образуемых субпопуляций не известны;
  • Каждой комбинации субпопуляций однозначно соответствует конкретное иммунологическое состояние кожи, выражаемое в клиническом симптоме.

Исходя из этих предположений построен ряд концептов, позволивших различить разнообразие ситуаций, возникающих в коже при теоретическом расширении результатов ее исследовании на клеточном уровне.

Концепт «Разнообразия функций видовой клетки кожи»

Базисные множества:

Х1 – множество признаков клетки любого вида, которые экспериментально обнаруживаются специальными маркерами.

Родовое отношение: D1 ∈ B(Х1).

Здесь «В» – знак операции порождения множества из всех подмножеств исходного множества (булеан).

Тип этой структуры: «Множество всех подмножеств признаков клетки».

Поскольку у любой клетки каждого вида может проявиться любое сочетание признаков, то эта структура устанавливает полное разнообразие всех комбинаций признаков, которые только могут быть у кожной клетки любого вида. Учитывая, что каждая комбинация признаков клетки указывает на активность её определенной функции, то эта структура выражает одновременно полное разнообразие функций, которые могут активировать клетки, независимо от их вида.

Если количество признаков каждой клетки равно Р, а по одному из них определяют вид самой клетки, то разнообразие комбинаций признаков и, следовательно, функций клеток может достигать числа 2 (Р-1)-1. Здесь учтено, что если никаких признаков клетка не проявляет (пустое подмножество признаков – ∅) , то она функционально пассивна. С учетом известного количества признаков клетки каждого вида (Р=24), получается, что максимальная мощность гипотетического разнообразия функций одной клетки любого вида (F) составляет более 8 миллионов (конкретно: F=8388607). Причем, каждая из этих функций может быть различима.

Этот результат концептуализации позволяет теоретически выводить (определять) каждую функцию клетки, исследуя ее влияние на состояние здоровья; ставить задачи на поиск эффективных способов обнаружения функций; искать способы активизации каждой функции или её подавления. В настоящее время из всего разнообразия функций клеток кожи дерматологически учитывается ничтожная часть. Возможно, некоторые потенциальные функции не проявятся никогда или проявятся в каких-то уникальных ситуациях. Но, в отсутствие обоснованных утверждений на этот счет, нельзя исключать появление незнакомых функциональных феноменов клеток кожи. 

Концепт «Видовые клетки с функциями»

Базисные множества:

Х1 – множество признаков клетки любого вида, которые экспериментально обнаруживаются специальными маркерами;

Х2 – множество видов клеток кожи. Это все те отличные друг от друга клетки, которые участвуют в создании феноменов здоровья кожи.

Родовое отношение имеет следующий вид:

D2  ∈ Х2 × В(Х1).

Здесь «×» - знак декартового произведения множеств.

Тип этой структуры: «Множество видов клеток и множество их функций». Эта структура определяет все ситуации, в которых необходимо различать конкретные видовые клетки со всеми их функциями.

Эта структура определяет все ситуации, в которых необходимо различать конкретные видовые клетки со всеми их функциями. Разнообразие таких выделяемых составов более 100 млн. Конкретно F=100 663 284.

Этот концепт использован для постановки узких теоретических задач в дерматологии. Так, рассмотрение клеток с их полным набором функции позволяет исследовать особенности действия всех функций каждой видовой клетки. Может состояться  ответ на вопрос о том, изменит ли влияние на кожу то обстоятельство, что одна и та же функция проявится у разных видовых клеток одновременно. Исходя из того, что количество видовых клеток К=12, а количество функций каждой видовой клетки равно F=8 388 607, то  разнообразие составов «видовые клетки с их функциями» (S) равно S=R×F=100 663 284. Разумеется, на эмпирическое изучение свойств всех этих ситуаций понадобятся многие годы. Но, простор для теоретических исследований открыт.

Концепт «Разнообразие видовых клеток с наборами их функций»

Базисные множества этого концепта:

Х2 – множество видов клеток кожи;

Х3 – множество функций клеток.

Родовое отношение имеет следующий вид:

D3 ∈ В(Х2 × В(Х3)).

Тип этой структуры: «Множество подмножеств видовых клеток вместе с множеством подмножеств их функций». Она выражает все ситуации, когда в конкретной пункционной биопсии кожи можно рассматривать отдельно друг от друга такие субпопуляции, в которые собраны клетки всех видов (или лишь нескольких) вместе с их проявившимся функциями. Разнообразие их велико, но измеримо, конкретно это 2 100 663 284.

Такие ситуации, возникающие вследствие эволюции состояний клеток кожи,  являются «фенотипами субпопуляций». Они являются важным диагностическим признаком, позволяющим судить о течении процессов в коже. Под фенотипом следует понимать совокупность функционально значимых маркеров, характерных для определенных стадий дифференцировки, пролиферации, активации или программируемой клеточной гибели (апоптоза). Относительное и абсолютное количество клеток, имеющих тот или иной фенотип, как раз и является конечным результатом клеточных состояний. Разнообразие их велико:

  • Одинокие виды клеток и их функции. Это все те фенотипы субпопуляций, которые определяются предыдущим родом структуры.
  • Фенотипы субпопуляций, образованные из нескольких видов клеток (не всех) одномоментно вместе с их различными функциями; 
  • Фенотипы субпопуляций, образованные клетками всех видов, причем каждый вид клетки проявляет по одной-две своих функции;
  • Фенотипы субпопуляций, образованные клетками всех видов, причем каждый вид клетки проявляет все своих функции одновременно.

Этот концепт открывает возможность различать фенотипы с полными/неполными наборами видов клеток со всеми разнообразными активностями функций, включая и те, в которых все виды клеток одновременно проявляют все свои функции. На его основе уже можно ставить новые классы задач на исследования ситуаций здоровья/болезни с разными составами функций при полном наборе видовых клеток и других ситуаций. Но, в этих концептуальных конструкциях еще не учтены обстоятельства, когда в порции кожи оказывается какая-то определенная доля клеток каждого вида с конкретными (разными функциями). Это будет другой концепт, который выразит полное разнообразие фенотипов субпопуляций клеток. При этом могут быть выразимы необычные теоретически возможные ситуации. Например, когда при полном разнообразии клеток всех видов среди клеток одного вида окажутся клетки с разными наборами функций. Это принудит исследователей отвечать на серии вопросов о том, каковы свойства таких фенотипов субпопуляций клеток и как это сопряжено с патологиями, являющимися предметом изучения дерматологии, как науки о коже и её заболеваниях. 

Генетически детерминированный процесс формирования разнообразия специализированных фенотипов клеток, отражающих их функцию – результат координированной экспрессии определённого набора генов, в результате которого, дифференцировка клеток, изменяющая их функции, морфологию и метаболическую активность, создаёт предпосылки их высокой специализации и избирательности действие, что в конечном счёте реализуется в колоссальном разнообразии видимых дерматологами клинических феноменов одних и тех же заболеваний кожи.

Углубление этих концептуальных различений позволяет выйти на широкий класс исследовательских задач в дерматологии, опирающейся на различения фенотипов субпопуляций клеток кожи – фенотипическая дерматология.

 Результаты концептуализации указывают на возможность преображения современной дерматологии. Признаком этого преображения является то, что «единицей» исследования состояний кожи становится не картина ее патологических симптомов, а особенности субпопуляции клеток ее конкретного участка. Каждая особенная субпопуляция, состоящая из клеток одновременно всех видов, отражая специфическую функционально-клеточную структуру элементарного фрагмента кожи, представляет собой ее специфический фенотип. Переход от симптоматического подхода к исследованию и лечению кожи к фенотипическому является переходом к дерматологии другого, нового типа – к  фенотипической дерматологии. В ее основание должны быть положены механизмы цитоиммунологии, способной исследовать и использовать свойства всех возможных фенотипов субпопуляций клеток кожи.

В четвертой главе

исследуются возможности использования концептуальных различений фенотипов субпопуляций клеток для развития теории и практики дерматологии. 

В разнообразии построенных концептов выделены отдельные виды (термы), которые могли представлять значение для актуальной практики диагностики кожных патологий. Так, в одной из концептуальных схем выделен видовой концепт одного из фенотипов кожи, по отношению к которому была поставлена задача разработки технического устройства способного активировать функции образующих его клеток. 

Примером практического решения одной из названных задач фенотипической дерматологии является разработка амплификатора репаративных потенций. С учетом результатов концептуализации эта задача была сформулирована так: 

  1. Среди полного разнообразия фенотипов субпопуляций видовых клеток с наборами их функций, заданных концептуальной схемой D3, найти такой фенотип, который определяется следующим термом:

TR1 = {d ∈ D3⎜(Pr1d ∈ X2)}

2. Разработать техническое устройство, способное активировать функции клеток этого множества. 

В результате решения этой задачи был разработан амплификатор репаративных потенций клеток кожи – устройство для избирательной активации in vitro клеток кожи определенного фенотипа (Патент RU 159463 (Россия) от 29.07.2015). 

Рисунок 4. Устройство для избирательной активации in vitro клеток кожи определенного фенотипа. 

Это изобретение открыло возможность для создания ряда решений по так называемой «адресной доставке» активных веществ, благодаря тому, что динамика состояний кожи теперь может стать управляемой на уровне ее клеточного состава. 

Подтверждением этой мысли явилось изобретение ранозаживляющего средства Цельгель (Патент RU 2481115 (Россия) от 13.10.2011) , в основе которого использован эффект изменения фенотипа клеток CD34+CD45dim кожи посредством избирательного воздействия активатора ксеногенного происхождения. Это средств для заживления ран различной этиологии, применение которого подтверждено Протоколом испытаний № 594-12П/7-НТ от 24.12.2012 испытательной лабораторией №РОСС RU.0001.21АВ65 от 13.07.2011 и декларацией Таможенного Союза о соответствии №ТС RU Д-RU.АЛ14.В.03012 от 25.12.2012 г. Ряд подобных изобретений позволил создать эффект управляемого ранозаживления, обеспечив значительное (в несколько раз) сокращение его сроков, закрытие дефекта ткани с восстановлением функции, без образования рубца.

Так, ориентируясь на тезис о том, что процессы заживления подчиняются тем же принципам, что и процессы пролиферации и апоптоза, и регулируются через клеточно-клеточные и клеточно-матриксные сигналы, в результате проведенных исследований, были получены данные о дозозависимом влиянии ранозаживляющего средства Цельгель на жизнеспособность и процессы апоптоза клеток в культуре, благодаря чему был сделан вывод о том, что более глубокое изучение иммунных механизмов регуляции гибели клеток цитоиммунограммой кожи, может способствовать усилению эффективности ранозаживляющего средства Цельгель при его применении in vitro. Условием появления этого эффекта является активация специфических функций клеток кожи каждого вида, способ которой должен быть найден.

Эти результаты демонстрируют, что открывающиеся возможности фенотипической дерматологии указывают на особенные, новые пути к лечению заболеваний кожи, в которых лечение может стать управляемым процессом с заданными требованиями к ходу и результату. 

В пятой главе

формируются новые классы научно-исследовательских задач, значимых для дерматологии будущего. Показано, что каждый шаг концептуальных разработок должен и может сопровождаться формулировкой задач и направлений экспериментальных исследований, предназначенных для проверки теоретически выводимых понятий. Это позволяет, с одной стороны, стимулировать развитие дерматологической практики, соизмеримое со скоростью порождения новых концептов и, с другой стороны, создает условия для проверки практикой теоретических постулатов, корректируя ход концептуальных разработок.

На основе типологизации концептуального разнообразия, построенного в предыдущей главе, разработаны новые классы задач: 

  • задачи выявления полного разнообразия клеток кожи каждого вида, всех возможных признаков и функций клеток кожи каждого вида; 
  • задачи диагностики, выявления влияния возможных функций и комбинаций функций  клеток на состояния кожи; 
  • задачи выявления способов активации/подавления функций клеток каждого вида; 
  • задачи выявления  свойств переходов между состояниями популяций клеток с разнообразными функциональными возможностями; 
  • задачи выявления концентраций видовых клеток с разнообразно активированными функциями на состояния кожи; 
  • задачи выявления способов целенаправленного изменения (управления) переходов между состояниями популяций клеток и другие. 

Это задачи, которые не могли быть поставлены прежде.

Шестая глава

обобщает исследование до строгого выведения положений фенотипической дерматологии, как теории.

В заключении

изложены основные научные и практические результаты исследования.

Полученные в ходе исследовательской работы результаты позволяют сделать следующие выводы. 

ВЫВОДЫ

  1. Синтез методов экспериментальной дерматологии, технологически поднявшейся на уровень изучения и оперирования комплексами клеток кожи, с методами концептуального анализа результатов экспериментов показал свою продуктивность в порождении большого количества классов новых понятий в отрасли медицины, явно исчерпавшей потенциал сложившейся в ней научной парадигмы.
  2. Концептуализация феноменологии статических состояний субпопуляций клеток кожи обнаруживает классы потенциальных ситуаций, которые до сих пор не были различимы в дерматологии и не являлись предметом изучения и использования в лечебной практике. 
  3. Разработан способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи, позволяющий разделить клетки кожи с сохранением их жизнеспособности для дальнейших исследований по подбору и испытанию лекарственных препаратов при лечении кожных заболеваний in vitro, выделения и культивирования отдельных популяций клеток и разработки лекарственных препаратов нового поколения.
  4. Разработан способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограмм кожи, позволяющий исследовать и отображать в цифрах субпопуляционный состав клеток кожи и их функциональную активность. Изобретение позволяет дать прижизненную характеристику морфофункциональному состоянию клеток кожи человека, что открывает перспективу его использования в практической дерматологии.
  5. Предложена и внедрена в практическую работу диагностическая панель маркеров дифференцирования клеток, учитывающая степень активации различных субпопуляций клеток кожи и характеризующая динамику состояний субпопуляций клеток кожи, что объективно улучшает диагностику и мониторинг пациентов с заболеваниями кожи.
  6. Обосновано применение проточной цитометрии и получения цитоиммунограмм, как метода значительно расширяющего возможности клинико-диагностических и научных исследований кожи.
  7. Углубление концептуальных различений клеточных феноменов, стоящих за феноменами патологий кожи, позволяет сформировать новые научно-исследовательские направления в медицине. Особенно перспективной в этом плане представляется концептуальная экспликация феноменологии динамики состояний кожи и обусловленной динамики этих состояний. 
  8. Построение и развертка концептуальных схем в этих предметных областях фенотипической дерматологии позволяет, во-первых, вывести ее на уровень прогнозов развития патологий, существенно опережающих фронт естественного усложнения заболеваний кожи. Во-вторых, это позволит привести лечебную практику к облику технологичного целенаправленного влияния на ход лечения заболеваний кожи, поскольку концептуальные различения проникнут в область способов искусственного вмешательства в динамику фенотипической картины кожи.
  9. Концептуально технологичная работа с большим количеством экспериментальных результатов, полученных в цитологии, иммунологии и дерматологии придаст экспансивный характер развитию этих отраслей знания и их межотраслевому синтезу.
  10. Разработано средство для заживления ран «Цельгель», способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством. Изобретение позволяет создать эффект управляемого ранозаживления, обеспечив значительное (в несколько раз) сокращение его сроков, закрытие дефекта ткани с восстановлением функции.
  11. Разработано устройство для активации репаративных потенций клеток кожи, позволяющее избирательно активировать in vitro клетки кожи определенного фенотипа.
  12. Полученные результаты свидетельствуют о решении сформулированной научной проблемы.

 

Основные результаты диссертационного исследования отражены в ряде публикаций автора. 

 

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ

Статьи в журналах из перечня ВАК РФ:

  1. Гольцов С.В. Алиментарная недостаточность в свете иммунологических отклонений у больных распространенным псориазом протекающим с вторичным иммунодефицитным состоянием / Гольцов С.В., Матусевич С.Л., Суховей Ю.Г., Матусевич Н.Н., Ковалева О.Л. // Вестник последипломного медицинского образования. 2001. № 1. С. 23-24.
  2. Матусевич С.Л. Влияние вторичного иммунодефицитного состояния на течение и клинические проявления распространенного псориаза / Матусевич С.Л., Гольцов С.В., Кунгуров Н.В., Суховей Ю.Г., Тузанкина И.А. // Российский журнал кожных и венерических болезней. 2001. № 5. С. 14-16.
  3. Кунгуров Н.В. Сравнительная характеристика иммунологических показателей у больных распространенным псориазом при наличии у них клинических признаков иммунодефицитного состояния / Кунгуров Н.В., Матусевич С.Л., Гольцов С.В., Суховей Ю.Г. //Весник дерматологии и венерологии. 2002. № 2. С. 33-36.
  4. Матаев С.И. Иммунокоррекция в терапии больных распространенным псориазом с помощью аминокислотного комплекса / Матаев С.И., Суховей Ю. Г., Матусевич С. Л., Гольцов С. В. // Вопросы питания. 2004. Том 73, № 2. С. 8-11.
  5. Гольцов С.В. Количество кератиноцитов и фибробластов как маркер старения кожи. /Гольцов С.В., Хлюпина Е.В.// Вестник Уральской медицинской академической науки. 2012. № 4(41). С. 68-69.
  6. Суховей Ю. Г. Регенераторно-репаративные и антибактериальные свойства препарата Cellgel в эксперименте. /Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Цирятьева С. Б., Аргунова Г. А., Унгер И. Г., Гольцов С. В.// Российский иммунологический журнал 2015, 9(2), 44. 
  7. Суховей Ю. Г. Возрастные характеристики показателей клеточных элементов кожи, как основа формирования технологий предупреждения старения. / Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Унгер И. Г., Гольцов С. В., Стрелин С. А., Акунеева Т. В. // Российский иммунологический журнал 2016, 2(19), 526–527. 
  8. Костоломова Е. Г. Некоторые иммунофизиологические механизмы регенерации ран в условиях применения ранозаживляющего средства Cellgel. / Костоломова Е. Г., Суховей Ю. Г., Гольцов С. В., Унгер И. Г., Акунеева Т. В. // Российский иммунологический журнал 2016, 10(19), 289–291.
  9. Гольцов С.В. Цитоиммунограмма кожи как способ оценки её иммунного статуса. /Гольцова Е.Н., Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Паульс В. Ю.// Косметика и медицина. 2017. №3. С. 56-58.
  10. Гольцов С. В. Цитоиммунограмма кожи – новый метод объективной оценки субпопуляционного состава клеток кожи. / Гольцов С. В., Гольцова Е. Н., Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Паульс В. Ю. // Медицинская иммунология. 2018, 20(3), 373–382 
  11. Гольцов С.В. Концептуализация состояний субпопуляций клеток кожи человека. /Гольцов С.В., Теслинов А.Г.// Российский иммунологический журнал. 2018. Т. 12(21), 11-20.

Патенты

  1. Гольцов С. В. Средство для заживления ран "Цельгель", способ его получения и способ лечения ран различной этиологии полученным средством. / Гольцов С. В., Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Унгер И. Г. // Патент RU 2481115 (Россия) от 13.10.2011 
  2. Гольцов С. В. Способ получения жизнеспособной гетерогенной популяции клеток кожи. / Гольцов С. В., Суховей Ю. Г., Митрофанов П. П. // Патент RU 2502999 (Россия) от 25.07.2012. 
  3. Гольцов С. В. Устройство для активации репаративных потенций клеток кожи. / Гольцов С. В., Суховей Ю. Г., Костоломова Е. Г., Паульс В. Ю. // Патент RU 159463 (Россия) от 29.07.2015
  4. Гольцов С. В. Способ определения субпопуляционного состава клеток кожи и получения цитоиммунограммы кожи. / Гольцов С. В., Костоломова Е. Г., Суховей Ю. Г., Паульс В. Ю. // Патент RU 2630607 (Россия) от 02.06.2016

Монографии

  1. Гольцов С.В. Дерматовенерология. Наблюдения в фотографиях: учебное пособие. –Екатеринбург: "Медиа-холдинг "Уральский Рабочий". 2013. - 368 с.
  2. Кунгуров Н.В. Болезни кожи. /Кунгуров Н.В., Кохан М.М., Малишевская Н.П., Торопова Н.П., Зильберберг Н.В., Игликов В.А., Кениксфест Ю.В., Шакуров И.Г., Уфимцева М.А., Филимонкова Н.Н.. Бакуров Е.В., Бахтилин В.Я., Бочкарев Ю.М., Вишневская И.Ф., Воронова О.А., Горбунов А.П., Гольцов С.В., Гришаева Е.В., Кащеева Я.В., Кузнецов И.Д., Куклин И.А., Лашкина Н.С., Летаева О.В., Толстая А.И., Сафонова Г.Д., Гурковская Е. П., Гусарова Е.А., Николаева К. И., Римар О.Г., Полищук А.И., Стукова Е.И., Топычканова Е.П., Шакирова А.Н., Шефер А.Ю.// Монография. Атлас. Под редакцией профессора Кунгурова Н.В. - Екатеринбург: Государственное бюджетное учреждение Свердловской области "Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии". 2014. - 176 с.

Статьи в прочих журналах и сборниках

  1. Гольцов С. В., Сухнев Д. Ю., Майорова О. А. Иммуноцитограмма кожи – реальность или миф? Вестник Уральской медицинской академической науки 2012, 4(41), 25–26. 
  2. Гольцов С. В., Гольцова Е. Н., Гетьман А. Д., Юрков А. С., Чеснокова М. З., Шемонаева О. А. Cellgel – новое слово в ранозаживлении. Дерматология в России 2017, 1, 28–33.
  3. Гольцов С.В. Иммунопатологический тандем: распространенный псориаз и клинически верифицированное вторичное иммунодефицитное состояние / Гольцов С.В., Матусевич С.Л., Суховей Ю.Г. // Тюменский медицинский журнал. 2000. №3-4. С. 32-33.
  4. Кунгуров Н.В. Псориаз и вторичное иммунодефицитное состояние: иммунологическая характеристика взаимовлияния. / Кунгуров Н.В., Матусевич С.Л., Гольцов С.В. // Материалы юбилейной конф. посвящ. 75-летию Тверского ОКВД. – Тверь. 2000. С. 94-95.
  5. Гольцов С.В. Клинико-иммунологические особенности течения распространенного псориаза в составе микс-патологии с вторичным иммунодефицитным состоянием / Гольцов С.В., Матусевич С.Л., Суховей Ю.Г., Матусевич Н.Н., Ковалева О.Л. // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. 2001. № 1. С. 26-27.