Некоторые иммунофизиологические механизмы регенерации ран в условиях применения ранозаживляющего средства «Cellgel»

Проведен эксперимент на 40 половозрелых кроликах с целью сравнения пролиферативной и апоптотической активности клеток эпидермиса и дермы при формировании грубого соединительнотканного рубца и эпителизации раны без образования рубца с восстановлением функции поврежденного участка. Методом иммуногистохимии выявлены индекс пролиферации (Ki-67-позитивные клетки) и индекс готовности к апоптозу (CD95-позитивные клетки). Понимание роли апоптоза в образовании рубцовой ткани возможно, может собствовать поиску новых подходов к терапии, связанной с воздействием на иммунные механизмы регуляции гибели клеток и оценке эффективности применяемых лекарственных препаратов для профилактики образования рубцов.

Ключевые слова: ранозаживляющее средство «Cellgel», репаративная регенерация, апоптоз

Введение

Раневой процесс представляет собой единство воспаления, регенерации и фиброза, которые являются неразрывными компонентами целостной тканевой реакции на повреждение. Сбой строго последовательных и протекающих зачастую одновременно процессов гистогенеза приводит к формированию патологических рубцов [1]. Апоптоз играет важную роль как в патогенезе образования рубцовой ткани, так и в поддержании гомеостаза здоровой кожи [2]. Ранозаживляющее средсво «Cellgel» разработано с учетом фазы течения раневого процесса, что позволяет применять его при повреждениях кожи различной этиологии. Действующее ве- щество средства «Cellgel», полученно из экстракта клеток куриного эмбриона, обладает антибактериальной активностью, а так же активизирует процессы репаративной регенерации кожи [3]. Тем не менее, несмотря на перспективность применения ранозаживляющего средства «Cellgel» в терапии различных нозологических единиц, следует констатировать недостаточный уровень изученности механизмов его действия на течение раневого процесса.

Цель работы: изучение индекса пролиферации и апоптоза клеток эпидермиса и дермы в условиях применения ранозаживляющего средства «Cellgel» в эксперименте.

Материалы и методы

Эксперимент выполнен на 40 половозрелых кроликах – самцах. Под общим обезболиванием на спине животного по паравертебральной линии формировали инфицированные раны мягких тканей по ранее описанной методике [3]. После формирования инфицированной раны через 3-5 суток начинали лечение. Животные были разделены на 2 группы (по 20 кролов в каждой), перевязки проводили 1 раз в день:

1. В группе контроля лечение проводили традиционным методом: после обработки краев раны раствором Люголя, рану промывали 3 % раствором перекиси водорода, осушали. В фазу воспаления применяли повязки с водным рас- твором антисептика, мазями на водной осно- ве, в фазу регенерации и эпителизации – мази на жировой основе.
2. В экспериментальной группе после обработки краев раны раствором Люголя на рану с 1 суток наносили ранозаживляющее средство «Cellgel». После образования пленки из геля на рану накладывали стерильную салфетку.

С 1 по 25 сутки под местной анестезией выполняли биопсию раны через все слои на глубину до 1.8-2.2 см. Материал фиксировали в 96% этиловом спирте, заливали в парафин и готовили гистологические срезы.

Иммуногистохимические реакции проводили в парафиновых срезах с использованием соответствующих первичных антител Ki 67, CD95 / Apo 1, (DAKO) и системы визуализации En vision. Ядра докрашивали гематоксилином. Тепловое демаскирование антигенов проводили в микроволновой печи Samsung М 1915 NR.

Результаты исследования и их обсуждение

До начала лечения раны неправильно округлой формы, размер составляет 3.9-4.1 см в диаметре. Вокруг раны очаг инфильтрации до 3.5 см в диаметре. Стенки раны плотные, спаяны с окружающими тканями, дно покрыто плотным налетом фибрина, выделяется до 2-3 мл гнойного отделяемого белесоватого цвета тестоватой консистенции. Глубина язвенного дефекта до 2 см. При гистологическом исследовании определяются очаги некроза в соединительной и мышечной ткани, расширение кровеносных сосудов со стазом крови, экссудация лейкоцитов. Сосочковый слой дермы имеет четкое разграничение на слои: с выраженной клеточной инфильтрацией, представленной моноцитами, единичными макрофагами и рыхлой соединительной тканью с большим количеством фиброцитов, единичными фибробластами, единичными моноцитами, плазмоцитами.

У животных в группе (традиционное лечение) закрытие раневого дефекта происходит к 20 суткам, с формированием грубого соединительнотканного рубца гистологически сохраняются дистрофически – дегенеративные изменения подкожной клетчатки и мышц, дегенеративные изменения нервных стволиков.

В экспериментальной группе на 10 сутки эксперимента наблюдается полная эпителизация раневого дефекта с его оволосением. Гистологическая картина эпителизации раны с сохра- нением всех функционирующих структур.

Эпителизация раны без образования соединительнотканного рубца с восстановлением функции поврежденного участка (рост волосяного покрова) характеризует потенцирование веществом, выделенным из экстракта клеток куринного эмбриона, механизмов физиологической репаративной регенерации.

Пролиферативную активность клеток эпидермиса и дермы изучали с помощью моноклональных антител Ki 67 (MIB-1), которые идентифицируют ядерный антиген, присутствующий у большинства пролиферативных клеток. Антиген Ki 67, определяемый соответствующими моноклональными антителами, короткоживущий протеин, разрушающийся на протяжении 1-1,5 часа. Благодаря этому Ki 67 выявляется только в клетках, которые делятся, т.к. не успевает накапливаться и не остается в спокойных клетках [4].

Для оценки процессов программированной клеточной гибели использовали моноклональные антитела к Fas-рецепторам (CD95/Apo 1). Используется для определения числа клеток, находящихся в стадии апоптоза.

При иммуногистохимическом исследовании до начала лечения количество клеток экспрессирующих маркер CD95+ и маркер пролиферации – Ki67+ одинаково во всех экспериментальных.

В экспериментальной группе при применении ранозаживляющего средства «Cellgel» на 1-3 сутки эксперимента наблюдается рост носителей CD95+ с последующим его снижением, начиная 3-5 суток. Начиная с 1 суток, наблюдается рост носителей маркера Ki67+ и продолжается до 15 суток эксперимента. На 3-5 сутки возникает «перекрест маркеров», что, на наш взгляд, характеризует переход первой фазы раневого процесса во вторую: завершение процессов гибели клеток и начало активных пролиферативных процессов.

В группе контроля (традиционное лечение) наблюдается снижение уровня маркера готовности клеток к апоптозу. На 5 сутки эксперимента наблюдается некоторый всплеск уровня маркера пролиферации с дальнейшим его уменьшением практически до нуля.

В эпидермисе молодых рубцов обнаруживаются активные процессы пролиферации. Метка локализуется в ядрах клеток базального и шиповатого слоя. В дерме метка присутствует в округлых клетках. Они имеются в сосудах и между коллагеновыми волокнами зоны роста. Возможно, это клетки фибробластического ряда. Экспрессия белка Fas, свидетель- ствующая о том, что эпидермоциты готовы к апоптозу, была обнаружена в клетках базального и шиповатого слоя. В дерме метки нет.

Выводы: 

1. Вещество, выделенное из экстракта клеток куринного эмбриона является индуктором апоптоза в первую фазу раневого процесса.
2. Во вторую и третью фазы раневого процесса данное вещество индуцирует механизмы физиологической репаративной регенерации.

   Таким образом, применение влиянием вещества, выделенного из экстракта клеток куринного эмбриона и входящего в состав ранозаживляющего средства «Cellgel» в качестве индукторов апоптоза и пролиферации открывает совершенно новые перспективы регуляции раневого процесса.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Chang S. E. Sphingosine may have cytotoxic effects via apoptosis on the growth of keloid fibroblasts / S. E. Chang, K. J. Kim, K. H. Ro // J. Dermatol.– 2004.– Vol. 31.– P. 1-5.
2. FesusL.P. Apoptosis; Molecular mechanisms in programmed cell death / L. P. Fesus, J. A. Davis, M. Piacentini // Europ. J. Cell Biol.– 1991.– Vol. 747.– P. 195-204.
3. Суховей Ю.Г., Костоломова Е.Г., Цирятьева С. Б., Аргунова Г. А., Унгер И. Г., Гольцов С. В. Регенераторно-репаративные и антибактери- альные свойства препарата «Cellgel» в эксперименте//Российский Иммунологический Журнал, 2015, том 9 (18), No 2 (1). с 44-46.4. [Regenerative and reparative antibacterial characteristics of the drug «CELLGEL» in experiment Sukhovey J. G., Kostolomova E. G., Tsyryateva S. B., Argunova G. A., UngerI.G., GoltsovS.V. // Russian Journal of im- munology, 2015, 9 (18), No 2 (1). с 44-46.4. 2]
4. Cell proliferation in the growing human heart: MIB-1 immunostaining in preterm and term infants at autopsy/ V. Huttenbach, M. L. Ostrowski, D. Thaller, H. S. Kim // Cardiovask. Pathol.– 2001.– Vol. 10.– No3.– P. 119-123.