В связи с увеличением количества трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пуповинной крови (ПК) и расширением показаний к их клиническому применению проблема создания банков длительного хранения стволовых клеток является весьма актуальной [1, 2]. Успех трансплантаций аллогенных ГСК ПК во многом зависит от качества и безопасности заготовленного клеточного материала [3, 4, 5].
Криоконсервирование является неотъемлемой частью процедуры длительного хранения клеточных биоматериалов. В большинстве случаев клетки сохраняют свою морфологию после замораживания-размораживания, но может наблюдаться снижение их жизнеспособности и нарушение клеточных функций, приводящее к снижению пролиферативных свойств и нарушению биологической активности.
Вопросы сохранности ГСК ПК на этапе их криоконсервирования и хранения, а также оценка их пролиферативного потенциала и способности к дифференцировке in vitro и in vivo требуют постоянного изучения и совершенствования.
В исследовании использовалось 40 образцов пуповинной крови, полученных во время физиологических срочных родов. Информированное согласие рожениц на сбор пуповинной крови и проведение эксперимента было получено.
Сбор образцов пуповинной крови проводился в родильных домах г. Тюмени. Для исследований отбирались образцы, объем которых превышал 80 мл. ПК собирали в систему для сбора крови (Green Cross, Корея), содержащую стандартное количество гемоконсерванта CPDA (цитратно-фосфатно-декстрозно-адениновый раствор).
Выделение ГСК ПК проводили методом ав- томатического выделения клеток с помощью клеточного сепаратора «SepaxS1000» (Biosafe, Швейцария).
В качестве криопротектора к концентрату ядросодержащих клеток ПК добавляли высокоочищенный диметилсульфоксид (ДМСО) в сочетании с полиглюкином. Конечная концентрация ДМСО в криоконсервируемой среде составляла 5%. Для криоконсервирования концентрата клеток пуповинной крови использовались два способа замораживания: спонтанное замораживание в парах жидкого азота и криоконсервирование в программном замораживателе PLANER Krio 560-16 (ENGLAND) автоматическим контролем про- цесса охлаждения каждого образца клеток. Количество и жизнеспособность ГСК ПК оценивали), методом проточной цитометрии на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FS-500 Cytomics (Beckman Coulter, США) с помощью набора Stem-Kit TM Reagents (Beckman Coulter, США).
С целью изучения пролиферативного потенциала ГСК ПК определяли длину их теломер и колониеобразующую способность (КОЕ). КОЕ ГСК пуповинной крови определяли с помощью культивирования клеточной суспензии в метилцеллюлозе в течение 14 сут. при температуре 37 °С в СО2 инкубаторе с подсчетом количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 × 105: КОЕ-ГМ – гранулоцитарных-макрофагальных, КОЕ-Г – гранулоцитарных, КОЕ-М – макрофагальных, КОЕ-Эр –эритроцитарных, КОЕ-mix – смешанных. Для определения абсолютного количества гемопоэтических предшественников в 1 мл пуповинной крови, полученные величины КОЕ умножали на число мононуклеарных клеток в 1 мл крови.
Для определения длины теломер использовался набор PNA Kit/FITC (DAKO, Дания). Гибридизация клеток с теломерным зондом проводилась в соответствии с рекомендациями фирмы DAKO. В образцах, гибридизиро- ванных с теломерным зондом, производилось определение длины теломер на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter FS-500 Cytomics (Beckman Coulter, Швейцария). Для исследования использовался световой фильтр с длиной волны 488 нм. Интенсивность флуоресценции выставляли при флуоресцентном сигнале в FL-1. Гейтировали клетки в G0/1 фазе клеточного цикла, где клетка имеет только одну копию своего генома. Оценка количества жизнеспособности и пролиферативной активности проводилась до и после криоконсервации.
Математическую обработку данных проводили при помощи программы Kaluzav. 1.2 (Beckman Coulter, США). Статистическую обработку данных проводили при помощи программного обеспечения Statistica 6.1 (StatSoft).
Средний срок криохранения образцов ГСК ПК составил от 6 до 12 мес., средний объем криоконсервированных образцов – 19,9±1,1 мл. Жизнеспособность (CD45+7AAD-) ядросо- держащих клеток ПК до (96,3±3,1%) и после криоконсервации в программном замораживателе и парах азота составила (89,0±3,4% и 77,4±3,4%) соответственно (рис. 1). Абсолютное количество CD34+-клеток после автоматической криоконсервации ПК снижалось с 0,18±0,05 × 106/мл до 0,11±0,03 × 106/мл и до 0,08±0,04 × 106/мл в парах азота.
КОЕ ГСК является достоверным показате- лем их пролиферативного потенциала. При исследовании КОС ГСК до замораживания среднее количество колоний на 1 × 105 ГСК ПК составило 40,28±2,45, КОЕ ГСК ПК, криоконсервированных в программном замораживателе в среднем составила 39,66±1,09 при криоконсервировании в парах жидкого азота – 21,86±2,71 соответственно. При оценке КОЕ клеток ПК было показано, что количество колоний после криоконсервации в автоматизированной системе снижается не значительно в сравнении с замораживанием в парах азота (табл. 1, рис. 2).
Исследования зарубежных ученых сопо- ставимо с полученными результатами. В Японии при оценке качества 54 криоконсервированных образцов ПК из 9 различных банков ПК. Было показано, что процент сохранения ядросодержащих клеток, CD34+-клеток и КОЕ-ГМ составил 96,0±11,3%, 83,0±17,0% и 88,6±41,2%, соответственно [6].
Определение длины теломер ГСК ПК проводили с использованием новейшей методики сочетания флуоресцентной гибридизации in situ и проточной цитометрии. Для изучения влияния криоконсервирования на репликативный потенциал ГСК, зависящий от длины их теломер, нами было исследовано 40 образцов пуповинной крови. Выявлено достоверное уменьшение длины теломер в клетках после криоконсервирования (рис. 3, табл. 2).
При криоконсервировании клеток в программном замораживателе изменение пролиферативного потенциала ГСК ПК менее выражено, чем при замораживании в парах жидкого азота. Как известно, охлаждение биологического объекта с любой скоростью всегда сопровождается образованием разнообразных кристаллов льда. В момент перехода растворенной в клетке воды в кристаллическую форму – достижении точки эвтектики – происходит выделение дополнительного тепла за счет образования кристаллической решетки при переходе воды из жидкого состояния в твердое. Основные повреждения клетки наступают в точке перекристаллизации, так как в этот период образуются концентрированные растворы солей, которые повреждают клеточные структуры. Этот период не должен длиться более 1,5 мин [7, 8, 9]. В проведенных нами исследованиях при замораживании в программном замораживателе время от наступления точки эвтектики и кристаллизации сокращено до 1,5 мин, а при замораживании в парах жидкого азота это время длилось более 5 мин.
Укорочение длины теломер при замораживании клеток ПК может быть связано с процессами повреждения ядерной мембраны [4, 10], так, как именно она повреждается при криоконсервировании в первую очередь [7]. Процессы криоконсервирования клеток могут приводить к транзиторным или органическим поражениям этих структур, и таким образом вызывать апоптоз клеток, что, безусловно, сказывается на их восстановлении после размораживания [8]. Уменьшение длины теломер возможно, приводит к изменению экспрессии генов, что также может сказаться на функции клетки [4, 10].
E.G. Kostolomova,
Y.G. Sukhovey,
S.V. Goltsov,
D.Y. Sukhnev
Таким образом, при оценке жизнеспособности и пролиферативного потенциала ГСК ПК установлено, что замораживание в парах жидкого азота приводит к потерям клетками их пролиферативных свойств. Использовать такие клетки для трансплантации следует с большой осторожностью, так как при восстановлении гемопоэза из относительно малого количества ГСК ПК с низким пролиферативным потенциалом восстановление объема ниши стволовой клетки произойдет не полностью. При криоконсервировании в программном замораживателе наблюдается лучшая сохранность пролиферативных свойств ГСК ПК, поэтому использование данного метода сохранения образцов клеток ПК для дальнейшего клинического применения предпочтительнее, так как позволяет сохранить клетки в жизнеспособном и функ- ционально полноценном состоянии. Длина теломер и КОЕ может служить важным маркером сохранности пролиферативного потенциала ГСК ПК.
Криоконсервирование индуцирует физиологическое старение клеток. Представленные данные позволяют сделать вывод о том, что не подходящие условия криоконсервирования могут не только снижать жизнеспособность клеток, но и также индуцировать апоптоз. Полученные нами данные являются важными для областей медицины, которые используют замороженные клетки.
Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А. и др. Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. «Медпракти- ка-М», Москва 2005.
Gluckman E., Rocha V. Cord blood transplantation for children with acute leukaemia: a Eurocord reg- istry analysis. Blood cells, molecules, and diseases 2004, 33(3), 271–273.
Абдулкадыров К.М., Романенко Н.А., Стар- ков Н.Н. и др. Вопросы онкологии 2000, 46, 513–520.
Blackburn E.H. FEBS Lett. 2005, 579(4), 859–862. 5. Wagner J.E., Barker J.N., DeFor T.E. et al. Blood 2002, 100, 1611–1616.
Miura J., Minegishi M., Itoh T. et al. Cryobiology 2008, 57(2), 178–181.
Hunt J., Armitage E., Pegg E. Cryobiology 2003, 46, 76–87.
Honda S., Weigel A., Hjelmeland M. et al. Biochem. Biophys. Research Comm. 2001, 282, 493–498. 9. Mazur P. Am. J. Physiol. 1984, 125–142.
Lansdorp M. Blood. 2008, 111, 1759–1766.
Действительно, когда кончается дорога - символ благоустройства, основа порядка градостроения, обязательный элемент в системе современных отношений, то начинается... направление - символ свободы выбора. Помните, в фильме «Кин-дза-дза»:
– Будем считать, что Ашхабад там! 
Recently I have been asked this question.
This has made me ponder. As you know only dead people do not perspire… If this question has been asked, if it concerns somebody including me and if my feelings give rise to new thoughts then he is rather alive. From the perspective of the doctor stating the facts of the patients being discontent of the quality of the medical care provided he may be dead!
But as the woman cannot be just a little bit pregnant then a person cannot be half or partly alive or dead. Besides ...
Сведений об истории медицинских учреждений Тюмени, которая раньше относилась к Тобольской губернии, сохранилось немного. Известно, что в 1741 году в городе находился госпиталь, в котором числилось 3 служителя. Госпиталь располагался при монастыре. В первой половине XIX века (1845 год) в городе функционировала уже одна больница. По медицинскому ведомству служило 5 чиновников (врачей) и 7 нижних служителей (санитаров). В 1859 году была открыта городская больница, по мнению современников — лучшая в Западной Сибири, располагающая шестью больничными палатами, лабораторией, аптекой, анатомическим театром... вся история
It was for a good reason that our penetration into the island as well as the Papuan culture was carried out in a gradual and unhurried way… Including the most ancient form of relationship, the trade. More...
